包括選擇和富集步驟的染色體構(gòu)象捕獲方法
【專利說明】包括選擇和富集步驟的染色體構(gòu)象捕獲方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于鑒定與靶核酸區(qū)段相互作用的核酸區(qū)段的方法，特別是用于鑒定 與靶核酸區(qū)段的子集相互作用的核酸區(qū)段的方法，以及用于進(jìn)行該方法的試劑盒。本發(fā)明 還涉及鑒定一種或多種指示特定疾病狀態(tài)的相互作用核酸區(qū)段的方法。
[0002] 發(fā)明背景 調(diào)控元件在生物體的遺傳控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并已被證明促成健康和疾病(例如癌 癥和自身免疫性疾?。?。這些調(diào)控元件的鑒定也可以在分子生物學(xué)中具有潛在的應(yīng)用，例如 在表達(dá)系統(tǒng)和遺傳修飾技術(shù)中。然而，雖然數(shù)以千計(jì)的調(diào)控元件已經(jīng)在小鼠和人的基因組 中作圖，但是確定它們調(diào)節(jié)哪些目標(biāo)基因代表一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。已經(jīng)證明調(diào)控DNA序列（例 如，增強(qiáng)子)可以跨過(bridge)相當(dāng)?shù)幕蚪M距離以與它們的靶基因相互作用?；蚣捌湔{(diào) 控區(qū)之間的染色體接觸可以被捕獲，但目前缺失在全基因組規(guī)模將基因連接到其調(diào)控序列 的方法。
[0003] 開發(fā)以鑒定基因組基因座之間相互作用的最早的方法之一是染色體構(gòu)象捕獲 (3C)技術(shù)(Dekker等Science (2002) 295:1306-1311)。這涉及通過如下產(chǎn)生3C文庫：交 聯(lián)核組合物，以便空間上緊密鄰近的基因組基因座被連接;通過消化除去交聯(lián)之間的插入 DNA( intervening DNA)環(huán);并且連接和逆轉(zhuǎn)交聯(lián)相互作用區(qū)域以生成3C文庫。所述文庫然 后可以用于計(jì)算已知序列間相互作用頻率。但是此方法需要先前的相互作用的知識(shí)，以便 檢測(cè)目標(biāo)相互作用區(qū)域。
[0004] 從那之后，該技術(shù)已經(jīng)進(jìn)一步開發(fā)以嘗試和克服3C法的限制。例如4C法使用反向 PCR以鑒定其中特異性相互作用是未知的誘t耳序列的相互作用（Simonis等Nat. Genet. (2006) 38:1341-1347;和Zhao 等 Nat. Genet. (2006) 38:1348-1354)。然而，該方法對(duì) 時(shí)間和資源兩者是昂貴的，設(shè)計(jì)用來檢測(cè)與僅一個(gè)誘餌基因組基因座的相互作用，并且僅 是半定量的。
[0005] Hi -C方法使用連接標(biāo)志物以分離細(xì)胞中所有的連接的相互作用序列（參見W0 2010/036323和Lieberman-Aiden 等，Science (2009) 326:289-93)。雖然這提供了關(guān)于 在特定時(shí)間點(diǎn)上核組合物內(nèi)發(fā)生的所有相互作用的信息，但是每個(gè)細(xì)胞有約800，000個(gè)可 連接的片段(例如，如果具有6個(gè)堿基對(duì)的識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，如Hindm或Bgin已被 用于Hi-C文庫的生成），這使得文庫過于復(fù)雜且阻止特定個(gè)別區(qū)域之間的相互作用的問詢。
[0006] 因此，需要提供克服了現(xiàn)有方法局限性的用于鑒定核酸相互作用的改進(jìn)的方法。
[0007] 發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了用于鑒定與靶核酸區(qū)段子集相互作用的核酸區(qū)段的 方法，所述方法包括以下步驟： (a) 獲得包含靶核酸區(qū)段子集的核酸組合物； (b) 交聯(lián)核酸組合物； (c) 通過超聲處理片段化交聯(lián)的核組合物； (d) 連接從步驟(c)得到的片段化的核酸區(qū)段以產(chǎn)生連接的片段； (e) 添加結(jié)合靶核酸區(qū)段子集的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子用結(jié)合對(duì) 的第一半標(biāo)記； (f) 通過使用所述結(jié)合對(duì)的第二半分離連接的片段，其包含結(jié)合到分離的核酸分子的 靶核酸區(qū)段的子集;和 (g) 測(cè)序來自步驟(f)的分離的連接的片段以鑒定與靶核酸區(qū)段子集相互作用的核酸 區(qū)段。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了鑒定一種或多種指示特定疾病狀態(tài)的相互作 用核酸區(qū)段的方法，其包括： a) 對(duì)從具有特定疾病狀態(tài)的個(gè)體獲得的核酸組合物執(zhí)行本文定義的方法； b) 定量核酸區(qū)段和靶核酸區(qū)段之間的相互作用頻率； c) 比較來自具有所述疾病狀態(tài)的個(gè)體的核酸組合物中相互作用頻率與來自健康主體 的正常對(duì)照核酸組合物中相互作用頻率，使得核酸組合物中相互作用頻率的差異指示特定 疾病狀態(tài)。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了用于鑒定與靶核酸區(qū)段子集相互作用的核酸區(qū) 段的試劑盒，其包含能夠進(jìn)行本文所限定的方法的緩沖液和試劑。
[0010] 附圖簡(jiǎn)述 圖1:本文描述的發(fā)明的實(shí)施方案的示意圖概述。 圖2:使用本文所述方法獲得的結(jié)果。圖2(A)展示了 MYC基因周圍的基因組區(qū)域和MYC基 因在⑶34+細(xì)胞中的染色體相互作用概況。圖2(B)顯示了⑶34+細(xì)胞核的DNA FISH的實(shí)例。 圖2 (C)顯示使用3C方法對(duì)MYC啟動(dòng)子和在所述基因下游1.8Mb處區(qū)域的相互作用的驗(yàn)證。
[0011] 發(fā)明詳述 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了用于鑒定與靶核酸區(qū)段子集相互作用的核酸區(qū)段的 方法，所述方法包括以下步驟： (a) 獲得包含靶核酸區(qū)段子集的核酸組合物； (b) 交聯(lián)核酸組合物； (c) 通過超聲處理片段化交聯(lián)的核酸組合物； (d) 連接從步驟(c)得到的片段化的核酸區(qū)段以產(chǎn)生連接的片段； (e) 添加結(jié)合靶核酸區(qū)段子集的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子用結(jié)合對(duì) 的第一半標(biāo)記； (f) 通過使用所述結(jié)合對(duì)的第二半分離連接的片段，其包含結(jié)合到分離的核酸分子的 靶核酸區(qū)段的子集;和 (g) 測(cè)序來自步驟(f)的分離的連接的片段以鑒定與靶核酸區(qū)段子集相互作用的核酸 區(qū)段。
[0012] 根據(jù)可以提及的本發(fā)明的第二方面，提供了用于鑒定與靶核酸區(qū)段相互作用的核 酸區(qū)段的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 獲得包含靶核酸區(qū)段的核酸組合物； (b) 交聯(lián)核酸組合物； (c )片段化交聯(lián)的核組合物； (d)連接從步驟(c)得到的片段化的核酸區(qū)段以產(chǎn)生連接的片段； (e) 添加配置以結(jié)合靶核酸區(qū)段的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子用結(jié)合 對(duì)的第一半標(biāo)記； (f) 通過使用所述結(jié)合對(duì)的第二半分離連接的片段，其包含結(jié)合到分離的核酸分子的 靶核酸區(qū)段;和 (g) 測(cè)序來自步驟(f)的分離的連接的片段以鑒定與靶核酸區(qū)段相互作用的核酸區(qū)段。
[0013] 本發(fā)明的方法提供了通過使用分離的核酸分子分離靶核酸區(qū)段用于鑒定相互作 用序列的手段，特別是分離靶核酸區(qū)段子集的分離的核酸分子。這有助于在非常復(fù)雜的文 庫內(nèi)將數(shù)據(jù)集中在特定的相互作用，并可以用于組織信息成各種子集，其取決于所用的分 離的核酸分子的類型（例如啟動(dòng)子，以鑒定啟動(dòng)子相互作用）。然后可以獲得在特定子集內(nèi) 的染色體相互作用的詳細(xì)信息。
[0014] 盡管以前的技術(shù)，諸如4C，允許一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子的全基因組相互作用的捕獲，但 本文描述的方法可以在一個(gè)單一實(shí)驗(yàn)中捕獲超過22，000個(gè)啟動(dòng)子以及它們的相互作用基 因組基因座。此外，本方法產(chǎn)生了顯著更定量的讀出。
[0015] 全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS)已經(jīng)鑒定了數(shù)千個(gè)與疾病有聯(lián)系的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。然而，許多這些SNP位置距離基因很遠(yuǎn)，使得預(yù)測(cè)它們對(duì)其作用的基因非常具有挑戰(zhàn) 性。因此，本方法提供了鑒定相互作用核酸區(qū)段的一種方式，即使它們?cè)诨蚪M內(nèi)位置遠(yuǎn)離 彼此。
[0016] 如本文所用，提及"核酸區(qū)段"，相當(dāng)于提及"核酸序列"，并且指的是核苷酸（即，例 如，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，鳥嘌呤(G)，和/或尿嘧啶(U))的任何聚合物。這種 聚合物可以產(chǎn)生或可以不產(chǎn)生功能性基因組片段或基因。核酸序列的組合最終可包括一個(gè) 染色體。包含脫氧核糖核苷的核酸序列被稱為脫氧核糖核酸(DNA)。包含核糖核苷的核酸序 列被稱為核糖核酸（RNAhRNA可進(jìn)一步表征為幾個(gè)類型，諸如蛋白質(zhì)編碼RNA、信使RNA (mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、長(zhǎng)的非編碼RNA(lnRNA)、長(zhǎng)基因間非編碼RNA(lincRNA)、反義RNA (asRNA)、微 RNA(miRNA)、短干擾 RNA( s iRNA)、小核（snRNA)和小核仁 RNA( snoRNA)。
[0017] "單核苷酸多態(tài)性"或"SNP"是基因組內(nèi)的單核苷酸變化（即A，C，G或T)，其在生物 物種的成員之間或成對(duì)染色體之間不同。
[0018] 應(yīng)當(dāng)理解，"靶核酸區(qū)段"指的是用戶熟知的目標(biāo)序列。只分離含有靶核酸區(qū)段的 連接片段有助于集中數(shù)據(jù)以鑒定與特定目標(biāo)基因的特異性相互作用。
[0019]本文提及的術(shù)語"相互作用"，是指兩個(gè)元件之間的關(guān)聯(lián)(association)，例如在本 方法中，核酸區(qū)段和靶核酸區(qū)段之間的基因組相互作用。相互作用通常導(dǎo)致一個(gè)相互作用 元件對(duì)另一個(gè)具有影響，例如，沉默或激活其結(jié)合的元件。相互作用可以在線性基因組序列 上位置靠近在一起或相距甚遠(yuǎn)的兩個(gè)核酸區(qū)段之間發(fā)生。
[0020] 本文提及的術(shù)語"核酸組合物"，是指包含核酸和蛋白質(zhì)的任何組合物。核酸組合 物中的核酸可以被組織成染色體，其中蛋白（即，例如，組蛋白）可以與具有調(diào)控功能的染色 體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸組合物包含核組合物。這樣的核組合物可以通常包括核基 因組組構(gòu)或染色質(zhì)。
[0021] 如本文所用，提及"交聯(lián)"，是指兩種化合物之間任何穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)合，使得它們可 以作為一個(gè)單元被進(jìn)一步加工。這種穩(wěn)定性可以基于共價(jià)和/或非共價(jià)鍵合（例如，離子 的）。例如，核酸和/或蛋白質(zhì)可以是通過化學(xué)劑（即，例如，固定劑）、熱、壓力、pH變化或輻射 而交聯(lián)，使得它們?cè)诔Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)室程序（即，例如，提取、洗滌、離心等)過程中保持其空間關(guān) 系。如本文所用交聯(lián)等價(jià)于術(shù)語"固定"，其適用于固定任何和所有的細(xì)胞過程的任何方法 或過程。因此，交聯(lián)/固定的細(xì)胞，精確地保持核酸組合物內(nèi)的組分之間在固定時(shí)的空間關(guān) 系。許多化學(xué)品能夠提供固定，包括但不限于，甲醛、福爾馬林、或戊二醛。
[0022] 提及如本文所用術(shù)語"片段"，指的是比其來源的序列短的任何核酸序列。片段可 以是任何大小，范圍從幾兆堿基和/或千堿基到只有幾個(gè)核苷酸長(zhǎng)。片段合適地長(zhǎng)度大于5 個(gè)核苷酸堿基，例如長(zhǎng)度 10、15、20、25、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、5000 或 10000個(gè)核苷酸堿基。片段可以甚至更長(zhǎng)，例如長(zhǎng)度1、5、10、20、25、50、75、100、200、300、400 或500個(gè)核苷酸千堿基。本發(fā)明的第二方面中，方法諸如限制性內(nèi)切酶消化、超聲處理、酸孵 育、堿孵育、微流化等，都可以使用以片段化核酸組合物。
[0023] 本文提及的術(shù)語"連接的"，是指通常包含磷酸二酯鍵的兩個(gè)核酸區(qū)段的任何連 接。通常通過催化酶(即，例如，連接酶諸如T4 DNA連接酶)的存在在輔因子試劑和能量來源 (即，例如，三磷酸腺苷(ATP))的存在下促進(jìn)連接。在本文描述的方法中，已被交聯(lián)的兩個(gè) 核酸區(qū)段的片段連接在一起以產(chǎn)生一個(gè)單一的連接的片段。
[0024] 本文提及"分離的核酸分子"是指由結(jié)合到靶核酸區(qū)段的核酸形成的分子。例如， 分離的核酸分子可含有靶核酸區(qū)段的互補(bǔ)序列，其然后將形成與靶核酸區(qū)段的核苷酸堿基 的相互作用（即，形成堿基對(duì)(bp))。應(yīng)當(dāng)理解，分離的核酸分子，例如生物素化的RNA，并不 需要含有靶核酸區(qū)段的整個(gè)互補(bǔ)序列以形成互補(bǔ)相互作用并將其從核酸組合物分離。分離 的核酸分子可以是至少10個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)，例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、 130、150、170、200、300、400、500、750、1000、2000、3000、4000或 5000個(gè)核苷酸堿基長(zhǎng)。
[0025] 本文提及"結(jié)合對(duì)"是指特異性識(shí)別彼此以形成連接的至少兩個(gè)部分（即，第一半 和第二半）。合適的結(jié)合對(duì)包括，例如，生物素和抗生物素蛋白或生物素和抗生物素蛋白的 衍生物，諸如鏈霉親和素和中性親和素(neutravidin)。
[0026] 本文提及"標(biāo)記"或"標(biāo)記的"指的是通過連接標(biāo)志物區(qū)分靶標(biāo)的過程，其中所述標(biāo) 志物包括對(duì)配體具有獨(dú)特親和力的特定部分(即，親和標(biāo)簽）。例如，標(biāo)記可用于選擇性地純 化分離的核酸序列（即，例如，通過親和層析）。這種標(biāo)記可包括但不限于，生物素標(biāo)記、組氨 酸標(biāo)記（即，6His)或FLAG標(biāo)記。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸分子，即，靶核酸分子的子集，選自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉 默基因或絕緣子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述靶核酸分子是啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的替代實(shí)施 方案中，所述靶核酸分子是絕緣子。
[0028] 本文提及的術(shù)語"啟動(dòng)子"是指利于可操作連接的編碼區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始的核酸序 列。啟動(dòng)子有時(shí)稱作"轉(zhuǎn)錄起始區(qū)"。調(diào)控元件通常與啟動(dòng)子相互作用，以激活或抑制轉(zhuǎn)錄。 [0029]本發(fā)明人已使用本發(fā)明的方法，以鑒定數(shù)千個(gè)啟動(dòng)子相互作用，且每個(gè)啟動(dòng)子發(fā) 生十到二十個(gè)相互作用。本文所描述的方法已經(jīng)鑒定了一些相互作用是細(xì)胞特異性的，或 者與不同的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。也已經(jīng)鑒定了相互作用的核酸區(qū)段之間大范圍的分隔距離-大部分相互作用在100千堿基內(nèi)，但有些可以擴(kuò)展到2兆堿基和更多。有趣的是，該方法也被 用于顯示活性和非活性基因兩者都形成相互作用。
[0030]被鑒定為與啟動(dòng)子相互作用的核酸區(qū)段是對(duì)于正確的遺傳控制所需的調(diào)控元件 的候選。他們的破壞可能會(huì)改變轉(zhuǎn)錄輸出，并導(dǎo)致疾病，因此，連接這些元件與它們的革巴基 因可以為新的治療提供潛在的新的藥物靶標(biāo)。
[0031]鑒定哪些調(diào)控元件與啟動(dòng)子相互作用對(duì)理解遺傳相互作用是至關(guān)重要的。本方法 還提供了在特定時(shí)間點(diǎn)觀察核酸組合物內(nèi)相互作用的快速方法（snapshot)，因此可以設(shè) 想，該方法可以在一系列的時(shí)間點(diǎn)或發(fā)育狀態(tài)或?qū)嶒?yàn)條件下進(jìn)行以建立細(xì)胞的核酸組合物 內(nèi)相互作用變化的畫面。
[0032]應(yīng)該理解的是，在一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸區(qū)段與包含調(diào)控元件的核酸區(qū)段相互 作用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，調(diào)控元件包括增強(qiáng)子、沉默基因或絕緣子。
[0033] 如本文所用術(shù)語"調(diào)控基因"，指的是編碼蛋白質(zhì)的任何核酸序列，其中所述蛋白 質(zhì)結(jié)合相同或不同的核酸序列，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率或以其他方式影響相同或不同核酸序列 的表達(dá)水平。如本文所用的術(shù)語"調(diào)控元件"，是指影響另一個(gè)基因組元件的活性狀態(tài)的任 何核酸序列。例如，各種調(diào)控元件可以包括，但不限于，增強(qiáng)子、激活子、阻遏物、絕緣子、啟 動(dòng)子或沉默基因。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶核酸分子是通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)測(cè)序鑒定的基 因組位點(diǎn)。ChIP測(cè)序?qū)嶒?yàn)通過交聯(lián)核酸組合物內(nèi)的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物分析蛋白質(zhì)-DNA相互 作用。然后(通過免疫沉淀)分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，隨后測(cè)序蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域。
[0035] 應(yīng)當(dāng)設(shè)想，在一些實(shí)施方案中，核酸區(qū)段位于與靶核酸區(qū)段相同的染色體上?？蛇x 地，核酸區(qū)段位于與靶核酸區(qū)段不同的染色體上。
[0036]該方法可以用于鑒定長(zhǎng)距離相互作用、短距離相互作用或緊密近鄰的相互作用。 如本文所用的術(shù)語"長(zhǎng)距離相互作用"，指的是檢測(cè)線性基因組序列內(nèi)相距很遠(yuǎn)的相互作用 核酸區(qū)段。這種類型的相互作用可以鑒定兩個(gè)基因組區(qū)域，其例如，位于同一染色體的不同 臂，或位于不同的染色體上。如本文所用的術(shù)語"短距離相互作用"，指的是檢測(cè)位于基因組 內(nèi)彼此相對(duì)接近的相互作用核酸區(qū)段。如本文所用的術(shù)語"緊密鄰近的相互作用"，指的是 檢測(cè)線性基因組內(nèi)非?？拷舜撕屠缦嗤虻囊徊糠值南嗷プ饔煤怂釁^(qū)段。
[0037]本發(fā)明人已證明SNP更經(jīng)常位于一個(gè)相互作用核酸區(qū)段而不是偶然(by chance) 所預(yù)期的，因此本發(fā)明的方法可用于鑒定哪些SNP相互作用并因此有可能調(diào)控特定基因。 [0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子是從細(xì)菌人工染色體(BAC)，F(xiàn)黏粒或粘粒獲 得。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分離的核酸分子從細(xì)菌人工染色體(BAC)中獲得。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子為DNA、cDNA或RNA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中， 分尚的核酸分子是RNA。
[0040] 分離核酸分子可以在一個(gè)合適的方法使用，諸如溶液雜交選擇（參見W02009/ 099602)。在該方法中，產(chǎn)生了一組"誘館"序列，以形成可被用于從樣品（即'池'）分離靶核 酸的子集的雜交混合物。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的第一半包含生物素并且結(jié)合對(duì)的第二半包括鏈霉親 和素。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，片段化（即，本發(fā)明第二方面的步驟(c))使用限制性內(nèi)切酶或 超聲處理進(jìn)行。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)