的時(shí)間。樣品的蒸發(fā)將導(dǎo)致未達(dá)最佳的雜交條件。
[0167] 將具有池 Hi-C文庫(kù)的PCR條(DNA;第14天步驟1)轉(zhuǎn)移到PCR儀器中，在下面標(biāo)記黑 色的位置，并開(kāi)始PCR程序。
[0168] 剛超過(guò)5分鐘后(一旦溫度已達(dá)到65°C)，將具有雜交緩沖液的PCR條(來(lái)自第14天， 步驟2)轉(zhuǎn)移到在PCR儀器中，在下面標(biāo)記灰色的位置。孵育5分鐘。
[0169] 5分鐘后(從PCR程序開(kāi)始起10分鐘），將具有生物素化RNA誘餌的PCR條(參見(jiàn)第14 天，步驟3)轉(zhuǎn)移到在PCR儀器中，在下面標(biāo)記交叉影線(xiàn)的位置。孵育2分鐘。
[0170] 2分鐘后，從含有雜交緩沖液的PCR條和含有生物素化RNA誘餌的PCR條上取下蓋 子。吸取13μ1雜交緩沖液到7μ1 RNA誘餌中（從灰色進(jìn)入交叉影線(xiàn)）。丟棄含有雜交緩沖液的 PCR條。立即進(jìn)行下一步。
：........................：..............S..............··..............：..............::..........................:、.............：..............：..............·、..............、.......................?
[0171] 從含有池 Hi-C文庫(kù)(DNA)的PCR條上取下蓋子。吸取9μ1的Hi-C文庫(kù)（由于蒸發(fā)可以 略少)到20μ1的具有雜交緩沖液的RNA誘餌中（從黑色進(jìn)入交叉影線(xiàn)）。丟棄含有Hi-c文庫(kù)的 空的PCR條。
[0172] 用PCR條管蓋(Agilent光學(xué)蓋8x條401425)立即封閉剩余的PCR條(現(xiàn)在含Hi-C文庫(kù)/雜交緩沖液/RNA誘餌），并在65 °C孵育24小時(shí)。
[0173] 第15天:鏈霉親和素-生物素下拉和洗滌 1.制備緩沖液： 室溫的結(jié)合緩沖液(BB, Agilent Technologies) 室溫的洗滌緩沖液I(WB I, Agilent Technologies) 在65°C的洗潘緩沖液II(WB II，Agilent Technologies) 室溫的NEB2 lx (NEB B7002S)。
[0174] 2.洗滌磁珠:在每個(gè)捕獲Hi-C樣品加入60μ1到1.5 ml低結(jié)合Eppendorf?管之前， 充分混合Dynabeads MyOne鏈霉親和素 T1 (Life Technologies 65601)。如下洗滌珠(對(duì) 于所有后續(xù)洗滌步驟相同的程序）： a) 加入200μ1 BB b) 渦旋混合(在低至中間設(shè)定)持續(xù)5秒。 c) 將管置于Dynal磁力分離器上（Life Technologies) d) 回收珠，棄上清。
[0175] 重復(fù)步驟a)至d)總共3次洗滌。
[0176] 3.生物素-鏈霉親和素下拉:鏈霉親和素珠在新的低結(jié)合Eppendorf管中200μ1的 ΒΒ中的時(shí)候，打開(kāi)PCR儀器的蓋子(在PCR儀器正在運(yùn)行時(shí)），吸取整個(gè)雜交反應(yīng)物到含有鏈 霉親和素珠的管中。
[0177] 在旋轉(zhuǎn)輪上在室溫下孵育30分鐘。
[0178] 4.洗滌，30分鐘后，將樣品置于磁力分離器上，棄上清，在500μ1 WB I中重懸珠， 并轉(zhuǎn)移到新的管中。在室溫下孵育15分鐘。每2-3分鐘渦旋每次5秒。
[0179] 在磁力分離器上分離珠和緩沖液，并除去上清液。在500μ1 WB 11(預(yù)熱到65°C)中 重懸并轉(zhuǎn)移到新的管。
[0180] 在65°C孵育10分鐘，并且每2至3分鐘渦旋（在低到中間設(shè)定）5秒。重復(fù)在WB II中 洗滌總共3次，均在65 °C。
[0181] 5.除去上清液后，在200μ1 1χΝΕΒ2中重懸并立即轉(zhuǎn)移到新管中。直接放回到磁力 分離器上并除去上清液。
[0182] 6.重懸在30μ1 lx NEB2中并轉(zhuǎn)移到新的管。"抓（catch)"在珠上的RNA/DNA混合 物雜交物現(xiàn)在已準(zhǔn)備好用于PCR擴(kuò)增。
[0183] 第16天:確定用于捕獲Hi-C文庫(kù)擴(kuò)增的PCR條件 1.為了確定用于Hi-C文庫(kù)的最佳PCR循環(huán)數(shù)，設(shè)置測(cè)試PCR具有6、7和9個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。設(shè) 置3個(gè)反應(yīng)，每個(gè)具有： 2.5μ1 珠上的捕獲Hi-C文庫(kù)DNA 5μ1 緩沖液 5x (Phusion NEB F531) 0.7μ1 dATP 10mM 0.7μ1 dCTP lOmM 0.7μ1 dGTP lOmM 0.7μ1 dTTP lOmM 0·075μ1 PE PCR 引物 1.0 (100μΜ) 0·075μ1 PE PCR 引物 2.0 (100μΜ) 0·3μ1 Phusion 聚合酶(NEB F531) 14.25μ1 Η20
[0184] 2.用下列條件運(yùn)行3個(gè)不同的PCR進(jìn)行η個(gè)循環(huán)： 1個(gè)循環(huán):98°C 30秒 65 °C 30 秒 72 °C 30 秒 n-2個(gè)循環(huán):98°C 10秒 65 °C 30 秒 72 °C 30 秒 1個(gè)循環(huán):98°C 10秒 65 °C 30 秒 72 °C 7分鐘。
[0185] 3.通過(guò)在1.5%瓊脂糖凝膠上運(yùn)行整個(gè)反應(yīng)物（25μ1)檢查擴(kuò)增的DNA的量。通常， 在300-600bp范圍內(nèi)的成片條帶應(yīng)當(dāng)剛好在6-7個(gè)擴(kuò)增循環(huán)時(shí)約可見(jiàn)。
[0186] 第17天:捕獲Hi-C文庫(kù)的最終PCR擴(kuò)增 1.設(shè)置X PCR反應(yīng)(捕獲HiC文庫(kù)剩余體積除以2.5)，每個(gè)具有25以1，如第16天步驟1 中所述，用一個(gè)PCR條件（即，選擇的PCR循環(huán)數(shù)）。通常，4個(gè)PCR循環(huán)應(yīng)當(dāng)足以獲得適合用于 Illumina測(cè)序的捕獲Hi-C文庫(kù)的量。
[0187] 2.合并來(lái)自第17天步驟1的所有個(gè)別PCR反應(yīng)物。置于磁力分離器上并轉(zhuǎn)移上清 液到新的1.5ml低結(jié)合Eppendorf管中。在初始量的IX NE緩沖液2中重懸鏈霉親和素珠(參 見(jiàn)第15天，步驟6)，并保留作為備份。確定捕獲Hi-C文庫(kù)的體積，并通過(guò)加入1.8倍體積的 SPRI珠 (Beckman Coulter Ampure XP珠 A63881)，按照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純化。重懸在100μ 1 TLE 中。
[0188] 3.通過(guò)向來(lái)自第17天步驟2的100μΙ Hi-C文庫(kù)加入180μ1 SPRI珠，重復(fù)SPRI珠純 化(如第17天步驟2中所述）。重懸在終體積20μ1 TLE中。
[0189] 4.在測(cè)序前，通過(guò)Bioanalyzer (Agilent)和定量PCR檢查捕獲Hi-C文庫(kù)的質(zhì)量 和數(shù)量。
[0190]實(shí)施例2:與誘餌基因座(SCRiBL)Hi-C方案相互作用的區(qū)域的序列捕獲 本研究描述了下列SCRiBL Hi-C的三個(gè)變體，其中的兩個(gè)(下面的b和c)允許樣品加條 形碼和多路復(fù)用(multiplexing): a) 常規(guī)SCRiBL Hi-C(未加條形碼的） b) 捕獲前加條形碼的SCRiBL Hi-C c) 捕獲后加條形碼的SCRiBL Hi-C。
[0191]按照實(shí)施例1中方案從第1到10天，然后繼續(xù)進(jìn)行下列步驟： a)常規(guī)SCRiBL Hi-C: 按照實(shí)施例1中方案從第11到13天，然后繼續(xù)進(jìn)行下面的步驟14。
[0192] b)捕獲前加條形碼的SCRiBL Hi-C: 第11天:生物素-鏈霉親和素下拉(pulldown)和銜接頭連接 1.使用Quant-iT PicoGreen (Life Technologies P7589)測(cè)定法確定DNA的產(chǎn)量。制 備樣品的1:20和1:50稀釋液。從40yg的起始材料的預(yù)期產(chǎn)量大約是10yg。
[0193] 為了避免過(guò)載珠(參見(jiàn)第11天，步驟4)，建議每150μ1鏈霉親和素珠使用不大于最 大2.5yg的DNA。
[0194] 2.通過(guò)使TruSeq通用銜接頭引物和TruSeq索引的銜接頭引物退火生成TruSeq銜 接頭：
[0195] 混合15μ1每種TruSeq銜接頭引物與70μ1 H2〇(總體積100μ1)。在PCR儀中，運(yùn)行以 下程序:95 °C 5分鐘，然后以每分鐘1°C降低溫度，直至達(dá)到4 °C。
[0196] 制備10至20μ1的TruSeq銜接頭等分試樣（15μΜ)，儲(chǔ)存在_20°C，并在臨用前解凍等 分試樣。
[0197] 3.制備緩沖液： a) TB (吐溫緩沖液）：5mM Tris, 0.5mM EDTA，1M NaCl，0.05% 吐溫 每個(gè)樣品制備1600μ1 b) ΝΤΒ (無(wú)吐溫緩沖液）：5mM Tris, 0.5mM EDTA, 1Μ NaCl 每個(gè)樣品制備600yl c) NTB 2x: lOmM Tris, ImM EDTA, 2M NaCl 每個(gè)樣品制備300yl d) 連接緩沖液（ΙΟχ連接緩沖液NEB B0202S): lx 每個(gè)樣品制備150μ1 e) ΝΕ緩沖液2: lx 每個(gè)樣品制備300yl。
[0198] 4·轉(zhuǎn)移 150μ1 Dynabeads MyOne 鏈霉親和素 Cl珠 （Life Technologies 650.01) 懸浮液到低結(jié)合1 · 5ml Eppendorf管中。
[0199] 每2yg至2.5yg的DNA設(shè)置一個(gè)反應(yīng)，如第11天步驟1確定的。
[0200] 5.用400μ1 TB洗滌珠兩次。洗滌步驟總是如下： a) 將樣品置于磁力分離器上并回收珠 b) 棄上清 c) 加入新的緩沖液，充分混合，并將樣品轉(zhuǎn)移到新的管 d) 在室溫下旋轉(zhuǎn)樣品3分鐘 e) 參見(jiàn)a)。
[0201] 6.在300μ1 NTB 2x中重懸珠。用TLE將Hi-C DNA(參見(jiàn)第11天步驟1)體積補(bǔ)足到 300μ1〇
[0202] 在Hi-C文庫(kù)DNA的量超過(guò)為2.5yg的情況下（參見(jiàn)第11天，步驟1和步驟4)，制備足 夠數(shù)量的Hi-C樣品，每個(gè)在300μ1 TLE的總體積中包含最多2.5yg的DNA。
[0203] 組合珠與Hi-C DNA(總體積600μ1)。在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)30分鐘。
[0204] 7.將樣品置于磁力分離器上，回收具有結(jié)合的Hi-C DNA的珠，棄去上清液，并用 400μ1 NTB洗滌一次，然后用200μ1 IX連接緩沖液再洗滌一次。
[0205] 8.重懸在50μ1 lx連接緩沖液中并轉(zhuǎn)移到新的管。加入4μ1退火的15μΜ TruSeq 銜接頭(參見(jiàn)第11天，步驟2)和4μ1 T4 DNA連接酶(NEB M0202S)。在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)2小時(shí)。 [0206] 9.將樣品置于磁力分離器上，回收Hi-C結(jié)合珠，并每次用400 μL TB洗滌兩次。
[0207] 10.用200μ1 ΙχΝΤΒ洗滌，然后用200μ1 ΙχΝΕ緩沖液2洗滌。
[0208] 11.用60μ1的IX NE緩沖液2洗滌，然后在40μ1 IX NE緩沖液2中重懸珠并轉(zhuǎn)移到 新管。如果每個(gè)Hi-C文庫(kù)執(zhí)行超過(guò)一個(gè)鏈霉親和素-生物素下拉（即，如果Hi-C文庫(kù)的起始 量超過(guò)2.5ygDNA，參見(jiàn)第11天，步驟1和4)，則合并所有反應(yīng)物。儲(chǔ)存在4°C。
[0209] 第12天:測(cè)試PCR以確定用于Hi-C文庫(kù)擴(kuò)增的條件 1.為了確定用于Hi-c文庫(kù)的最佳PCR循環(huán)數(shù)，設(shè)置測(cè)試PCR具有6、9、12和15個(gè)擴(kuò)增循 環(huán)。設(shè)置4個(gè)反應(yīng)，每個(gè)具有： 2.5μ1 珠上的Hi-C文庫(kù)DNA 5μ1 緩沖液 5x (Phusion NEB F531) 0.7μ1 dATP lOmM 0.7μ1 dCTP lOmM 0.7μ1 dGTP lOmM 0.7μ1 dTTP lOmM 0·075μ1 TruSeq PCR 引物 1.0 (100μΜ) 0·075μ1 TruSeq PCR 引物 2.0 (100μΜ) 0·3μ1 Phusion 聚合酶(NEB F531) 14.25μ1 Η20
[0210] 2.用下列條件運(yùn)行4個(gè)不同的PCR進(jìn)行η個(gè)循環(huán)： 1個(gè)循環(huán):98°C 30秒 62 °C 30 秒 72 °C 30 秒 n-2個(gè)循環(huán):98°C 10秒 62 °C 30 秒 72 °C 30 秒 1個(gè)循環(huán):98°C 10秒 62 °C 30 秒 72 °C 7分鐘。
[0211] 3.通過(guò)在1.5%瓊脂糖凝膠上運(yùn)行整個(gè)反應(yīng)物（25μ1)檢查擴(kuò)增的DNA的量。通常， 在300到600bp范圍內(nèi)的成片條帶應(yīng)該剛好在9(在某些情況下，6)個(gè)擴(kuò)增循環(huán)時(shí)約可見(jiàn)，并 隨著PCR循環(huán)數(shù)目增加而強(qiáng)度增加。
[0212] 第13天:Hi-C文庫(kù)的最終PCR擴(kuò)增 1.設(shè)置X PCR反應(yīng)(HiC文庫(kù)剩余體積除以2.5)，每個(gè)具有25以1，如第12天步驟1中所 述，用一個(gè)PCR條件（即循環(huán)數(shù)XPCR循環(huán)的數(shù)量將取決于Hi-C文庫(kù)的可用量和測(cè)試PCR(第 12天），但通常6-7個(gè)循環(huán)應(yīng)當(dāng)足以獲得用于捕獲Hi-C所需的約500ngHi-C文庫(kù)(參見(jiàn)下文）。
[0213] 2.合并來(lái)自第13天步驟1的所有個(gè)別PCR反應(yīng)物。置于磁力分離器上并轉(zhuǎn)移上清 液到新的1.5ml低結(jié)合Eppendorf管中。在初始量的IX NE緩沖液2中重懸鏈霉親和素珠(參 見(jiàn)第11天，步驟11)，并保留作為備份。確定含有擴(kuò)增的Hi-C文庫(kù)的上清液的體積，并通過(guò)加 入1·8χ體積的SPRI珠 （Beckman Coulter Ampure XP珠 A63881)，按照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純 化。重懸在1〇〇μ1 TLE中。
[0214] 3.通過(guò)向來(lái)自第13天步驟2的100μΙ Hi-C文庫(kù)加入180μ1 SPRI珠，重復(fù)SPRI珠純 化(如第13天步驟2中所述）。重懸在終體積20μ1 TLE中。
[0215] 4.通過(guò)Bioanalyzer (Agilent)檢查Hi_C文庫(kù)的質(zhì)量和數(shù)量。保留50 ng至100 ng的Hi-C文庫(kù)用于下一代測(cè)序。
[0216]前進(jìn)到第14天 c)捕獲后加條形碼的SCRiBL Hi-C: 第11天:生物素-鏈霉親和素下拉(pulldown)和銜接頭連接 1.使用Quant-iT PicoGreen (Life Technologies P7589)測(cè)定法確定DNA的產(chǎn)量。制 備樣品的1:20和1:50稀釋液。從40yg的起始材料的預(yù)期產(chǎn)量大約是10yg。
[0217] 為了避免過(guò)載珠(參見(jiàn)第11天，步驟4)，建議每150μ1鏈霉親和素珠使用不大于最 大2.5yg的DNA。
[0218] 2.通過(guò)退火SCRiBL銜接頭引物1和2生成SCRiBL銜接頭：
[0219] 混合15μ1每種SCRiBL銜接頭引物與70μ1 H20(總體積100μΙ)。在PCR儀中，運(yùn)行以 下程序:95 °C 5分鐘，然后以每分鐘1°C降低溫度，直至達(dá)到4°C。
[0220]制備10至20μ1的SCRiBL銜接頭等分試樣（15μΜ)，儲(chǔ)存在-20°C，并在臨用前解凍等 分試樣。
[0221] 3.制備緩沖液： a) TB (吐溫緩沖液）：5mM Tris, 0.5mM EDTA，1M NaCl，0.05% 吐溫 每個(gè)樣品制備1600μ1 b) ΝΤΒ (無(wú)吐溫緩沖液）：5mM Tris, 0.5mM EDTA, 1Μ NaCl 每個(gè)樣品制備600yl c) NTB 2x: lOmM Tris, ImM EDTA, 2M NaCl 每個(gè)樣品制備300yl d) 連接緩沖液（ΙΟχ連接緩沖液NEB B0202S): lx 每個(gè)樣品制備150μ1 e) ΝΕ緩沖液2: lx 每個(gè)樣品制備300yl。
[0222] 4·轉(zhuǎn)移 150μ1 Dynabeads MyOne 鏈霉親和素 Cl珠 （Life Technologies 650.01) 懸浮液到低結(jié)合1 · 5ml Eppendorf管中。
[0223] 每2yg至2.5yg的DNA設(shè)置一個(gè)反應(yīng)，如第11天步驟1確定的。
[0224] 5.用400μ1 TB洗滌珠兩次。洗滌步驟總是如下： a) 將樣品置于磁力分離器上并回收珠 b) 棄上清 c) 加入新的緩沖液，充分混合，并將樣品轉(zhuǎn)移到新的管 d) 在室溫下旋轉(zhuǎn)樣品3分鐘 e) 參見(jiàn)a)。
[0225] 6.在300μ1 NTB 2x中重懸珠。用TLE將Hi-C DNA(參見(jiàn)