ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCdcF (SEQ ID MO： IS) 0.75μ1 SCRiBL阻斷寡核苷酸2 (200 μΜ原液）： AGATQ3GAAGAGCGTCGTGTAGGGAA.AGAGTGT (SEQ ID NO； 16) 0.75μ1 SCRiBL阻斷寡核苷酸3 (200 μΜ原液）： AGATCGGA.AGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC (S￡'Q ID NO： 1?} 0.75μ1 SCRiBL阻斷寡核苷酸4 (200 μΜ原液）： 轟森(seq id r'ia： is) * SCRiBL阻斷寡核苷酸1和4包含3'雙脫氧修飾 充分重懸，轉移到PCR條中（Agilent 410022)，用PCR條管蓋封閉(Agilent光學蓋8x 條401425)并保持在冰上。
[0275] 2.制備2·23χ雜交緩沖液(每個SCRiBL Hi-C樣品30μ1); II. 15x SSPE (原液 20x;Gibco 15591-043) 11 · 15x Denhardt，s (原液 50x; Invitrogen 750018) 11.15mM EDTA (原液 500mM;Gibco 15575-038) 0.223% SDS (原液 10%;Promega V6551) 充分混合，加熱到65°C持續(xù)5分鐘，轉移到PCR條中（Agilent 410022)，用PCR條管蓋封 閉(Agilent光學蓋8x條401425)并保持在室溫。
[0276] 3.制備生物素-RNA(誘餌）：轉移500ng的生物素化的RNA(第19天，步驟2)到1.5 ml低結合的Eppendorf管中，并用H2O補足5 · 5μ1的體積。添加1 · 5μ1 SUPERase_In(Ambion AM2694，20單位/μL)。轉移到PCR條中（Agi lent 410022)，用PCR條管蓋封閉(Agi lent光學 蓋8x條401425)并保持在冰上(體積現在應當是7μ1)。
[0277] 4.雜交反應:設置PCR儀器(PTC-200, MJ Research)到下列程序(全程必須加熱 PCR儀器蓋）： 1.95°C持續(xù)5分鐘 2.保持65°C 按照與實施例1的第14天步驟4相同的指導用于轉移PCR條。
[0278] 第21天:鏈霉親和素-生物素下拉和洗滌 1.制備緩沖液： a) 結合緩沖液（BB): 1M NaCl 10mM Tris-HCl pH 7.5 ImM EDTA 每個SCRiBL樣品制備800μ1并保持在室溫 b) 洗滌緩沖液I (WB I): lxSSC (SSC 20x 原液：Invitrogen 15557-044) 0.1% SDS 每個SCRiBL樣品制備500μ1并保持在室溫 c) 洗滌緩沖液II (WB II): O.lxSSC (SSC 20χ 原液：Invitrogen 15557-044) 0.1% SDS 每個SCRiBL樣品制備1500μ1，加熱到65 °C并保持在此溫度 d) NEB2 lx (10x 原液;NEB B7〇〇2S) 每個SCRiBL樣品制備230μ1并保持在室溫。
[0279] 2.洗滌磁珠:在每個SCRiBL Hi-C樣品加入60μ1到1.5 ml低結合Eppendorf管之 前，充分混合Dynabeads MyOne鏈霉親和素 T1 (Life Technologies 65601)。如下洗滌珠 (對于所有后續(xù)洗滌步驟相同的程序）： a) 加入200μ1 BB b) 渦旋混合(在低至中間設定)持續(xù)5秒。 c) 將管置于Dynal磁力分離器上（Life Technologies) d) 回收珠，棄上清。 重復步驟a)至d)總共3次洗滌。
[0280] 3.生物素-鏈霉親和素下拉:鏈霉親和素珠在新的低結合Eppendorf管中200μ1的 ΒΒ中的時候，打開PCR儀器的蓋子（同時PCR儀器仍然在運行），吸取整個雜交反應物到含有 鏈霉親和素珠的管中并充分混合。
[0281]在該點檢查雜交反應的體積。低于20μ1的體積意味著過度蒸發(fā)可能已導致未達最 佳的雜交條件。
[0282] 在旋轉輪上在室溫下孵育30分鐘。
[0283] 4.洗滌，30分鐘后，將樣品置于磁力分離器上，棄上清，在500μ1 WB I中重懸珠， 并轉移到新的管中。在室溫下孵育15分鐘。每2-3分鐘渦旋每次5秒。
[0284] 在磁力分離器上分離珠和緩沖液，并除去上清液。在500μ1 WB 11(預熱到65°C)中 重懸并轉移到新的管。
[0285] 在65°C孵育10分鐘，并且每2至3分鐘渦旋（在低到中間設定）5秒。重復在WB II中 總共3次洗滌，均在65 °C。
[0286] 5.除去上清液后，在200μ1 1χΝΕΒ2中重懸并立即轉移到新管中。直接放回到磁力 分離器上并除去上清液。
[0287] 6.重懸在30μ1 lx NEB2中并轉移到新的管。"抓"在珠上的RNA/DNA混合物雜交物 現在已準備好用于PCR擴增。
[0288] 第22天:確定用于SCRiBL Hi-C文庫擴增的PCR條件 a)常規(guī)SCRiBL Hi-C: 1.為了確定用于SCRiBL Hi-C文庫擴增的最佳PCR循環(huán)數，設置測試PCR具有7、9和12 個擴增循環(huán)。設置3個反應，每個具有： 2.5μ1 珠上的SCRiBL Hi-C文庫DNA 5μ1 緩沖液 5x (Phusion NEB F531) 0.7μ1 dATP lOmM 0.7μ1 dCTP lOmM 0.7μ1 dGTP lOmM 0.7μ1 dTTP lOmM 0·075μ1 PE PCR 引物 1.0 (100μΜ) 0·075μ1 PE PCR 引物 2.0 (100μΜ) 0·3μ1 Phusion 聚合酶(NEB F531) 14.25μ1 Η20
[0289] 2.用下列條件運行3個不同的PCR進行η個循環(huán)： 1個循環(huán):98°C 30秒 65 °C 30 秒 72 °C 30 秒 n-2個循環(huán):98°C 10秒 65 °C 30 秒 72 °C 30 秒 1個循環(huán):98°C 10秒 65 °C 30 秒 72 °C 7分鐘。
[0290] 3.通過在1.5%瓊脂糖凝膠上運行整個反應物（25μ1)檢查擴增的DNA的量。通常， 在300-600bp范圍內的成片條帶應當剛好在9個擴增循環(huán)時約可見。
[0291] 第22天:確定用于SCRiBL Hi-C文庫擴增的PCR條件 b) 捕獲前加條形碼的SCRiBL Hi-C 1.為了確定用于SCRiBL Hi-C文庫擴增的最佳PCR循環(huán)數，設置測試PCR具有7、9和12 個擴增循環(huán)。設置3個反應，每個具有： 2.5μ1 珠上的SCRiBL Hi-C文庫DNA 5μ1 緩沖液 5x (Phusion NEB F531) 0.7μ1 dATP lOmM 0.7μ1 dCTP lOmM 0.7μ1 dGTP lOmM 0. 7μ1 dTTP lOmM 0·075μ1 TruSeq PCR 引物 1.0 (100μΜ) 0·075μ1 TruSeq PCR 引物 2.0 (100μΜ) 0·3μ1 Phusion 聚合酶(NEB F531) 14.25μ1 Η20〇
[0292] 2.用下列條件運行3個不同的PCR進行η個循環(huán)： 1個循環(huán):98°C 30秒 62 °C 30 秒 72 °C 30 秒 n-2個循環(huán):98°C 10秒 62 °C 30 秒 72 °C 30 秒 1個循環(huán):98°C 10秒 62 °C 30 秒 72 °C 7分鐘。
[0293] 3.通過在1.5%瓊脂糖凝膠上運行整個反應物（25μ1)檢查擴增的DNA的量。通常， 在300-600bp范圍內的成片條帶應當剛好在9個擴增循環(huán)時約可見。
[0294] 第22天:確定用于SCRiBL Hi-C文庫擴增的PCR條件 c) 捕獲后加條形碼的SCRiBL Hi-C 1. 為了確定用于SCRiBL Hi-C文庫擴增的最佳PCR循環(huán)數，設置測試PCR具有7、9和12 個擴增循環(huán)。設置3個反應，每個具有： 2.5μ 1 珠上的SCRiBL Hi-C文庫DNA 5μ1 緩沖液 5x (Phusion NEB F531) 0.7μ1 dATP lOmM 0.7μ1 dCTP lOmM 0.7μ1 dGTP lOmM 0.7μ1 dTTP lOmM 0·075μ1 SCRiBL 捕獲后PCR 引物 1.0 (100μΜ) 0·075μ1 SCRiBL 捕獲后PCR 引物 2.0 (100μΜ) 0·3μ1 Phusion 聚合酶(NEB F531) 14.25μ1 Η20
(請注意"ΝΝΝΝΝΝ"是條形碼）。
[0295] 2.用下列條件運行3個不同的PCR進行η個循環(huán)： 1個循環(huán):98°C 30秒 65 °C 30 秒 72 °C 30 秒 n-2個循環(huán):98°C 10秒 65 °C 30 秒 72 °C 30 秒 1個循環(huán):98°C 10秒 65 °C 30 秒 72 °C 7分鐘。
[0296] 3.通過在1.5%瓊脂糖凝膠上運行整個反應物（25μ1)檢查擴增的DNA的量。通常， 在300-600bp范圍內的成片條帶應當剛好在9個擴增循環(huán)時約可見。
[0297] 第23天:SCRiBL Hi-C文庫的最終PCR擴增 1.設置X PCR反應(X等于SCRiB HiC文庫剩余體積除以2.5)，每個具有25以1，如上述 (參見第22天步驟1)，用一個PCR條件（即，選擇的PCR循環(huán)數）。通常，6個PCR循環(huán)應當足以獲 得適合用于Illumina測序的SCRiBL Hi-C文庫的量。
[0298] 2.合并來自第23天步驟1的所有個別PCR反應。置于磁力分離器上并轉移上清液 到新的1.5ml低結合Eppendorf管中。在初始量的IX NE緩沖液2中重懸鏈霉親和素珠(參見 第21天，步驟6)，并保留作為備份。確定含有SCRiBL Hi-C文庫的上清液的體積，并通過加入 1.8x體積的SPRI珠 (Beckman Coulter Ampure XP珠 A63881)，按照制造商的指導進行純化。 重懸在100μ1 TLE中。
[0299] 3.通過向來自第23天步驟2的100ylHi-C文庫加入180ylSPRI珠，重復SPRI珠純化 (如第23天步驟2中所述）。重懸在終體積20μ1 TLE中。
[0300] 4.在測序前，通過Bioanalyzer (Agilent)和定量PCR檢查SCRiBL Hi-C文庫的質 量和數量。
[0301 ]實施例3 :MYC基因啟動子相互作用的研究 本文所述的方法允許對于數以千計的啟動子同時捕獲染色體相互作用，這隨后可以單 獨分析。作為一個實例，本文顯示MYC基因周圍的基因組相互作用。結果可參照如本文所示 圖2進行解釋。
[0302] 圖2(A)顯示MYC基因周圍的基因組區(qū)域。圖2(A)顯示與⑶34+造血祖細胞中的MYC 啟動子相互作用的區(qū)域位置，如通過本發(fā)明的方法所鑒定。星號表示位于如下所述確證的 基因的下游1.8 Mb的相互作用區(qū)域的位置。
[0303] 圖2(B)顯示⑶34+細胞核的DNA FISH的實例。在這些實驗中，對于MYC基因座中的 區(qū)域(如圖2(A)中條所示位置)特異性的熒光標記的DNA探針雜交到固定的CD34+細胞核中 的基因組。對935個基因座測量了這些探針之間的相對間隔距離。距離的定量顯示為盒須圖 (box and whiskers graph)。柱1顯示了MYC啟動子和遠端相互作用區(qū)域之間的間隔距離。 其間隔距離比MYC啟動子和在本發(fā)明方法中未顯示相互作用的插入區(qū)域、或插入區(qū)域和遠 端相互作用區(qū)域顯著更近，分別如柱2和3所示。P-值〈0.001。
[0304] 圖2 (C)顯示使用已知的3C方法對MYC啟動子和在所述基因下游1.8Mb處區(qū)域之間 的相互作用的驗證。MYC啟動子、遠端相互作用元件和插入區(qū)域的特異性引物被用于在來自 CD34 +細胞和GM12878細胞的三個獨立制備的3C相互作用文庫中擴增，其中在本發(fā)明的方 法中沒有檢測到相互作用。來自有限個循環(huán)的PCR的擴增產物在瓊脂糖凝膠上運行。L，DNA 梯狀標志物;Co,對照擴增產物;GM，從三個GM12878 3C文庫的擴增;⑶，從三個⑶34+ 3C 文庫的擴增；圖2(C)中的圖顯示了對于GM12878細胞(左)和⑶34 +細胞(右），相對對照擴增 產物標準化的，與插入區(qū)域(黑色柱)和相互作用區(qū)域(灰色柱)相互作用的MYC啟動子的凝 膠的定量。
[0305] 在圖2(B)和2(C)中呈現的數據因此用作圖2(A)中所示發(fā)現的驗證。總之，這些結 果表明，位于MYC基因的下游1.8Mb的區(qū)域與MYC啟動子以比在線性基因組序列上接近得多 的區(qū)域顯著更高的頻率相互作用，如由本發(fā)明的方法所預測的。
【主權項】
1. 用于鑒定與靶核酸區(qū)段子集相互作用的核酸區(qū)段的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 獲得包含靶核酸區(qū)段子集的核酸組合物； (b) 交聯所述核酸組合物； (c) 通過超聲處理片段化交聯的核酸組合物； (d) 連接從步驟(c)得到的片段化的核酸區(qū)段以產生連接的片段； (e) 添加結合靶核酸區(qū)段子集的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子用結合對 的第一半標記； (f) 通過使用所述結合對的第二半分離連接的片段，其包含結合到分離的核酸分子的 靶核酸區(qū)段的子集;和 (g) 測序來自步驟(f)的分離的連接的片段以鑒定與靶核酸區(qū)段子集相互作用的核酸 區(qū)段。2. 權利要求1的方法，其中靶核酸分子的子集選自啟動子、沉默基因、增強子或絕緣子， 諸如啟動子。3. 權利要求1或權利要求2的方法，其中所述分離的核酸分子從細菌人工染色體(BAC)、 F黏?；蛘沉＋@得。4. 權利要求1-3任一項的方法，其中所述分離的核酸分子是RNA。5. 權利要求1-4任一項的方法，其中所述結合對的第一半包含生物素并且所述結合對 的第二半包含鏈霉親和素。6. 權利要求1 _5任一項的方法，其額外包括在步驟(d )期間向連接的片段中并入連接標 志物。7. 權利要求6的方法，其中所述連接標志物包括生物素。8. 權利要求1-7任一項的方法，其額外包括在步驟(e)之前逆轉交聯。9. 權利要求6-8任一項的方法，其額外包括在步驟(e)之前純化所述核酸組合物以除去 不包含連接標志物的任何片段。10. 權利要求1-9任一項的方法，其額外包括在步驟(g)之前將配對的末端銜接頭序列 連接到分離的靶連接的片段的末端。11. 權利要求1-10任一項的方法，其額外包括在步驟(g)之前擴增分離的靶連接的片 段。12. 權利要求11的方法，其中所述擴增通過PCR進行。13. 權利要求1-12任一項的方法，其中所述核酸組合物源自哺乳動物細胞核，諸如人細 胞核。14. 權利要求1-12任一項的方法，其中所述核酸組合物源自非人細胞核，諸如小鼠細胞 核或植物細胞核。15. 鑒定一種或多種指示特定疾病狀態(tài)的相互作用核酸區(qū)段的方法，其包括： a) 對從具有特定疾病狀態(tài)的個體獲得的核酸組合物執(zhí)行權利要求1-14任一項的方法； b) 定量核酸區(qū)段和靶核酸區(qū)段之間的相互作用頻率； c) 比較來自具有所述疾病狀態(tài)的個體的核酸組合物中相互作用頻率與來自健康主體 的正常對照核組合物中相互作用頻率，使得核酸組合物中相互作用頻率的差異指示特定疾 病狀態(tài)。16. 權利要求15的方法，其中所述疾病狀態(tài)選自癌癥、自身免疫性疾病、發(fā)育性疾病或 遺傳障礙。17. 試劑盒，其用于鑒定與靶核酸區(qū)段子集相互作用的核酸區(qū)段，其包含能夠進行權利 要求1-14任一項的方法的緩沖液和試劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過使用分離的核酸分子鑒定與靶核酸區(qū)段相互作用的核酸區(qū)段的方法，以及用于所述方法的試劑盒。本發(fā)明還涉及鑒定一種或多種指示特定疾病狀態(tài)的相互作用核酸區(qū)段的方法。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105658813
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】P.弗拉澤, C.奧斯本, S.舍恩費爾德
【申請人】巴布拉哈姆研究院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年9月4日