107] 6.為了使DNA沉淀，加入1000yL 3M的乙酸鈉 PH5.2,和25 ml冰冷的100%乙醇至 每個管。在-20 °C孵育過夜。
[0108] 第4天:DNA純化，第II部分 1.在4°C以3500rpm離心30分鐘。
[0109] 2.棄上清，并在400μ1 ΙχΤΕ中重懸每個沉淀。在此步驟該DNA可以儲存在-20°C， 如果必要。
[0??0] 3.通過進(jìn)行2次苯酸:氯仿提取進(jìn)行另一輪純化。加入450μ1苯酸pH8.0:氯仿（1: 1)并渦旋1分鐘。將管以14，OOOrpm離心10分鐘，并將水相轉(zhuǎn)移到新管中。在第二次提取后， 通過加入O.lx體積的3M乙酸鈉 pH5.2和2.5x體積100%乙醇沉淀DNA，并在-20°C下孵育過 夜。
[0111] 第5天:DNA純化，第III部分 1.離心下沉淀的DNA(在4°C以14，OOOrpm進(jìn)行30分鐘)后，用70 %乙醇洗滌各DNA沉淀3 次，并在25μ1 1XTE中重新懸浮每一 DNA沉淀。
[0112] 2.合并所有Hi-C管的內(nèi)容物。
[0113] 3.使用Quant-iT PicoGreen (Life Technologies P7589)測定法確定DNA的產(chǎn) 量。制備1:200，1:500和1:1000稀釋液用于每個Hi-C文庫。
[0114] 第6+7天:Hi-C連接效率和質(zhì)量控制 1.為了檢查文庫的質(zhì)量和數(shù)量，在〇.8%瓊脂糖凝膠上運行來自Hi-C文庫的2μ1和6μ1 1:10稀釋的等分試樣。文庫應(yīng)當(dāng)運行為超過10 kb的非常緊的條帶。
[0115] 2. Hi-C標(biāo)記和Hi-C連接效率通過PCR消化測定法來驗證。HindllI位點(AAGCTT) 的成功填補(bǔ)和連接產(chǎn)生了用于限制性內(nèi)切酶Nhel的位點(GCTAGC)。
[0116]設(shè)置五個(相同）25μ1 PCR反應(yīng)以擴(kuò)增短距離連接產(chǎn)物（由兩個相鄰的限制性片段 形成），例如弗雷澤實驗室Calr對照。使用200 ng的每個Hi-C文庫作為模板。然后合并、純 化(Qiagen PCR純化試劑盒)PCR產(chǎn)物，并確定濃度(NanoDrop)。隨后，分成四個樣品（未消 化，用Hindm消化，用Nhel消化，和用Hindlll和Nhel兩者消化）。每個消化目標(biāo)是500至600 ng PCR產(chǎn)物。在1.5 %凝膠上運行消化的樣品后，3C和Hi-C連接事件的相對數(shù)量可以通過量 化切割和未切割的帶的強(qiáng)度進(jìn)行估計。
[0117] 3.檢查Hi-C文庫中已知的長距離相互作用，諸如在小鼠紅系細(xì)胞中Hbb和Eraf之 間。
[0118] 第8天:從非連接的DNA末端除去生物素 1.在非連接的DNA末端的生物素-14-dATP用T4 DNA聚合酶的核酸外切酶活性除去。對 于每個反應(yīng)(每個Hi-C文庫設(shè)置總共至少8個反應(yīng)，對應(yīng)總共40yg)，混合5yg的Hi-C文庫與 0·5μ1 10 mg/ml BSA，5yl 10XNE緩沖液2,2μ1 2.5mM dATP，和5μ1 T4 DNA聚合酶（NEB M0203L)，以50μ1的總體積。在20°C下孵育4小時。
[0119] 2.通過加入2ml 0.5 M EDTA pH8.0到每個管來停止反應(yīng)。
[0120] 3.從第8天步驟1合并各自2個反應(yīng)物(DNA總量現(xiàn)在每個樣品大約10yg)。
[0121] 為了純化DNA，如第4天步驟3中所述進(jìn)行苯酚:氯仿提取，隨后乙醇沉淀。在-20°C 孵育幾個小時至過夜。
[0122] 4.在4°C以14，OOOrpm離心樣品30分鐘。棄上清，并用70%乙醇洗滌一次。棄上清， 風(fēng)干DNA沉淀，每個樣品再懸浮于130μ1 H20(在此階段各樣品應(yīng)包含約10mg DNA)。
[0123] 第9天:DNA剪切和末端修復(fù) 1.使用Covaris E220進(jìn)行超聲處理。設(shè)置DNA剪切以獲得具有約400bp峰的片段： 占空比10% 峰入射功率(W): 140 每一次發(fā)射的循環(huán)(Cycles per burst):200 時間:55秒。
[0124] 2.超聲處理后，將各樣品的整個體積（130μ1)轉(zhuǎn)移到新鮮的Eppendorf管中。加入 以下： 18μ1 10X連接緩沖液(NEB B0202S) 18μ1 2.5mM 的 dNTP 混合物 6·5μ1 T4 DNA聚合酶(NEB M0203L) 6.5μ1 T4 DNA多核苷酸激酶(NEB M0201L) 1·3μ1 克列諾酶(NEB M0210L) 在室溫下孵育30分鐘。
[0125] 3.每個樣品分成兩個(每個含有約5yg的DNA，其是用于以下使用的柱的最大容 量)。
[0126] 根據(jù)制造商的指導(dǎo)用MinElute柱（Qiagen 28004)純化DNA。用 15μ1 TLE(10 mM Tris pH8.0,0.1mM EDTA)洗脫每個柱，并用另外15yL TLE重復(fù)洗脫。
[0127] 第10天:dATP的添加，SPRI珠大小選擇 I. 向來自第9天步驟3的剪切和末端修復(fù)的DNA(30yL)加入下列： 5μ1 NE緩沖液2 10x II. 5μ1 dATP ImM 3·5μ1 克列諾外切酶（Klenow ex〇-)(NEB M0212L) 在37 °C孵育30分鐘。
[0128] 2.在65°C孵育20分鐘以使酶失活，之后立即置于冰上。
[0129] 3.通過雙面SPRI珠大小選擇法(0.6x隨后是0.9x)對200和650堿基對之間的片段 進(jìn)行大小選擇。通過禍旋充分混合SPRI珠 (Beckman Coulter Ampure XP珠 A63881)，保持 在室溫下至少30分鐘。
[0130] a)合并來自第10天步驟1的兩個A尾樣品（目前總體積100μΙ)到新的管(A)。
[0131] b)對于每個樣品，用180μ1 SPRI珠溶液制備一個管(Β)。
[0132] c)從管(B)中取出60μ1 SPRI珠溶液加入具有100μΙ DNA溶液的管(A)(0.6x)。徹底 混合，在室溫下孵育10分鐘，并放置在磁力分離器上并回收含所需大小范圍內(nèi)的DNA的未結(jié) 合的上清液到新的管(管C)。丟棄含有珠的管(A)。
[0133] d)濃縮SPRI珠:將管(B)(包含120μ1溶液中的SPRI珠)放置在磁鐵上，并去除所有 上清液僅剩30μ1(即棄約90μ1上清液）。從磁鐵上取下管(B)并在剩余的30μ1體積中重懸珠。
[0134] e)從管(Β)將30μ1濃縮的珠（見上文）加入到管（C)(0.9x SPRI珠，即溶液中DNA相 對SPRI珠的比例為1:0.9)?；旌暇鶆?，在室溫下孵育至少10分鐘，放置在磁鐵上，并且棄上 清。用新鮮制備的70%的乙醇洗兩次。丟棄管(B)。
[0135] 4.在管（C)中在50μ1 TLE(Tris低-EDTA;10mM Tris，0.1mM EDTA)中重懸結(jié)合珠 的DNA，在室溫下孵育5分鐘，放置在磁鐵上并轉(zhuǎn)移上清液(包含您的大小選擇的DNA)到一個 新的管(D)中。丟棄含珠的管(C)。
[0136] 5.合并所有的Hi-C文庫樣品。
[0137] 第11天:生物素-鏈霉親和素下拉(pulldown)和銜接頭連接 1.使用Quant-iT PicoGreen (Life Technologies P7589)測定法確定DNA的產(chǎn)量。制 備1:20和1:50稀釋液用于您的樣品。從40yg的起始材料的預(yù)期產(chǎn)量大約是10yg。
[0138] 為了避免過載珠(參見第11天，步驟4)，建議每150μ1鏈霉親和素珠使用不大于最 大2.5yg的DNA。
[0139] 2.通過退火PE銜接頭引物1和2生成PE銜接頭：
[0140] 混合15μ1每種PE銜接頭引物與70μ1 H20(總體積100μΙ)。在PCR儀中，運行以下程 序:95 °C 5分鐘，然后以每分鐘1°C降低溫度，直至達(dá)到4 °C。
[0141] 制備10至20μ1的PE銜接頭等分試樣（15μΜ)，儲存在-20°C，并在臨用前解凍等分試 樣。
[0142] 3.制備緩沖液： a) TB (吐溫緩沖液）：5mM Tris, 0.5mM EDTA，1M NaCl，0.05% 吐溫 每個樣品制備1600μ1 b) ΝΤΒ (無吐溫緩沖液）：5mM Tris, 0.5mM EDTA, 1Μ NaCl 每個樣品制備600yl c) NTB 2x: lOmM Tris, ImM EDTA, 2M NaCl 每個樣品制備300yl d) 連接緩沖液（ΙΟχ連接緩沖液NEB B0202S): lx 每個樣品制備150μ1 e) ΝΕ緩沖液2: lx 每個樣品制備300yl。
[0143] 4.轉(zhuǎn)移 150μ1 Dynabeads MyOne 鏈霉親和素 Cl珠 （Life Technologies 650.01) 懸浮液到低結(jié)合1 · 5ml Eppendorf管中。
[0144] 每2yg至2.5yg的DNA設(shè)置一個反應(yīng)，如第11天步驟1確定的。
[0145] 5.用400μ1 TB洗滌珠兩次。洗滌步驟總是如下： a) 將樣品置于磁力分離器上并回收珠 b) 棄上清 c) 加入新的緩沖液，充分混合，并將樣品轉(zhuǎn)移到新的管 d) 在室溫下旋轉(zhuǎn)樣品3分鐘 e) 參見a)。
[0146] 6.在300μ1 NTB 2x中重懸珠。用TLE將Hi-C DNA(參見第11天步驟1)體積補(bǔ)足到 300μ1〇
[0147] 在Hi-C文庫DNA的量超過為2.5yg的情況下（參見第11天，步驟1和步驟4)，制備足 夠數(shù)量的Hi-C樣品，每個在300μ1 TLE的總體積中包含最多2.5yg的DNA。
[0148] 組合珠與Hi-C DNA(總體積600μ1)。在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)30分鐘。
[0149] 7.將樣品置于磁力分離器上，回收具有結(jié)合的Hi-C DNA的珠，棄去上清液，并用 400μ1 NTB洗滌一次，然后用200μ1 IX連接緩沖液再洗滌一次。
[0150] 8.在50μ1 lx連接緩沖液中重懸并轉(zhuǎn)移到新的管。加入4μ1退火的15μΜ ΡΕ銜接 頭(參見第11天，步驟2)和4μ1 Τ4 DNA連接酶(NEB M0202S)。在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)2小時。
[0151] 9.將樣品置于磁力分離器上，回收Hi-C結(jié)合珠，并用每次400 μL ΤΒ洗滌兩次。
[0152] 10.用200μ1 ΙχΝΤΒ洗滌，然后用200μ1 ΙχΝΕ緩沖液2洗滌。
[0153] 11.用60μ1的IX NE緩沖液2洗滌，然后在40μ1 IX NE緩沖液2中重懸珠并轉(zhuǎn)移到 新管。如果每個Hi-C文庫執(zhí)行超過一個鏈霉親和素-生物素下拉（即，如果Hi-C文庫的起始 量超過2.5ygDNA，參見第11天，步驟1和4)，則合并所有反應(yīng)物。儲存在4°C。
[0154] 第12天:測試PCR以確定用于Hi-C文庫擴(kuò)增的條件 1.為了確定用于Hi-C文庫的最佳PCR循環(huán)數(shù)，設(shè)置測試PCR具有6、9、12和15個擴(kuò)增循 環(huán)。設(shè)置4個反應(yīng)，每個具有： 2.5μ1 珠上的Hi-C文庫DNA 5μ1 緩沖液 5x (Phusion NEB F531) 0.7μ1 dATP 10mM 0.7μ1 dCTP lOmM 0.7μ1 dGTP lOmM 0. 7μ1 dTTP lOmM 0·075μ1 PE PCR 引物 1.0 (100μΜ) 0·075μ1 PE PCR 引物 2.0 (100μΜ) 0·3μ1 Phusion 聚合酶(NEB F531) 14.25μ1 Η20
[0155] 2.用下列條件運行4個不同的PCR進(jìn)行η個循環(huán)： 1個循環(huán):98°C 30秒 65 °C 30 秒 72 °C 30 秒 n-2個循環(huán):98°C 10秒 65 °C 30 秒 72 °C 30 秒 1個循環(huán):98°C 10秒 65 °C 30 秒 72 °C 7分鐘。
[0156] 3.通過在1.5%瓊脂糖凝膠上運行整個反應(yīng)物（25μ1)檢查擴(kuò)增的DNA的量。通常， 在300到600bp范圍內(nèi)的成片條帶(smear)應(yīng)該剛好在9(在某些情況下，6)個擴(kuò)增循環(huán)時約 可見，并隨著PCR循環(huán)數(shù)目增加而強(qiáng)度增加。
[0157] 第13天:Hi-C文庫的最終PCR擴(kuò)增 1. 設(shè)置X PCR反應(yīng)(HiC文庫剩余體積除以2.5)，每個具有25以1，如第12天步驟1中所 述，用一個PCR條件（即循環(huán)數(shù)XPCR循環(huán)的數(shù)量將取決于Hi-C文庫的可用量和測試PCR(第 12天），但通常6-7個循環(huán)應(yīng)當(dāng)足以獲得用于捕獲Hi-C所需的約500ng Hi-C文庫（參見下 文)。
[0158] 2.合并來自第13天步驟1的所有個別PCR反應(yīng)物。置于磁力分離器上并轉(zhuǎn)移上清 液到新的1.5ml低結(jié)合Eppendorf管中。在初始量的IX NE緩沖液2中重懸鏈霉親和素珠(參 見第11天，步驟11)，并保留作為備份。確定含有擴(kuò)增的Hi-C文庫的上清液的體積，并通過加 入1·8χ體積的SPRI珠 （Beckman Coulter Ampure XP珠 A63881)，按照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行純 化。重懸在1〇〇μ1 TLE中。
[0159] 3.通過向來自第13天步驟2的100μΙ Hi-C文庫加入180μ1 SPRI珠，重復(fù)SPRI珠純 化(如第13天步驟2中所述）。重懸在終體積20μ1 TLE中。
[0160] 4.通過Bioanalyzer (Agilent)檢查Hi_C文庫的質(zhì)量和數(shù)量。保留50 ng至100 ng的Hi-C文庫用于下一代測序。
[0161] 第14天:Hi-C文庫與生物素 -RNA的雜交 1. 制備Hi_C文庫(池）：轉(zhuǎn)移等同于500 ng的Hi_C文庫的體積至1.5 ml Eppendorf管 中，并用SpeedVac濃縮。保留50 ng至100 ng的Hi-C文庫用于下一代測序。蒸發(fā)所有液體后， 在3.4μ1的H20中重懸Hi-C DNA沉淀。加入下列組分： 2·5μ1 定制的封閉液(blocker) 1 (Agilent Technologies) 2·5μ1 定制的封閉液 2 (Agilent Technologies) 0·6μ1 定制的封閉液 3 (Agilent Technologies) 充分重懸，轉(zhuǎn)移到PCR條（strip)中（Agilent 410022)，用PCR條管蓋封閉（Agilent光 學(xué)蓋8x條401425)并保持在冰上。
[0162] 2.通過混合下列組分制備雜交緩沖液(每個捕獲Hi-C樣品49μ1): 25μ1 SureSelect 雜交溶液 1 (Agilent Technologies) ΙμL SureSelect 雜交溶液 2 (Agilent Technologies) 10μ1 SureSelect 雜交溶液 3 (Agilent Technologies) 13μ1 SureSelect 雜交溶液 4 (Agilent Technologies) 充分混合，加熱到65°C持續(xù)5分鐘，轉(zhuǎn)移到PCR條中（Agilent 410022)，用PCR條管蓋封 閉(Agilent光學(xué)蓋8x條401425)并保持在室溫。
[0163] 3.制備生物素 -RNA(誘餌）：轉(zhuǎn)移5μ1生物素化的RNA(100ngAil，定制的，Agilent Technologies)到1 · 5ml 低結(jié)合 Eppendorf 管中。
[0164] 使用不含核酸酶的水，以制備1 : 4稀釋的SureSelect RNase Block(Agi lent Technologies)，并向生物素化的RNA加入2μ1 RNase Block稀釋液。充分混合，轉(zhuǎn)移到PCR條 中（Agilent 410022)，用PCR條管蓋封閉(Agilent光學(xué)蓋8x條401425)并保持在冰上。
[0165] 4.雜交反應(yīng):設(shè)置PCR儀器(PTC-200, MJ Research)到下列程序： 1.95°C持續(xù)5分鐘 2. 保持65°(：。
[0166] PCR儀器蓋必須加熱。在整個過程中，動作迅速，并盡量使PCR儀器蓋打開盡可能短