細(xì)胞穩(wěn)定化的制作方法
【專利說明】細(xì)胞穩(wěn)定化 發(fā)明背景
[0001 ]本申請要求于2013年6月13日提交的美國臨時申請?zhí)?1 /834，517的權(quán)益，該臨時 申請通過引用全文并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞的穩(wěn)定化。 相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0003] 有核細(xì)胞(例如，真核細(xì)胞)的長期儲存通常需要在毒性冷凍保護(hù)劑DMSO的存在下 超低的溫度。除了由冷藏系統(tǒng)的常見失效導(dǎo)致的損失之外，活細(xì)胞從冷凍狀態(tài)的恢復(fù)是有 挑戰(zhàn)性的，且通常僅少部分的投入細(xì)胞存活。
[0004] 在過去的20年中，已花費數(shù)百萬美元的研究基金來嘗試開發(fā)用于在環(huán)境溫度下穩(wěn) 定化真核細(xì)胞的替代方法。運些努力背后的動力是環(huán)境溫度穩(wěn)定化的真核細(xì)胞儲備物用于 生物醫(yī)學(xué)研究、產(chǎn)品開發(fā)W及在診斷學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、治療學(xué)、血液供應(yīng)物流學(xué)和細(xì)胞移植中 直接應(yīng)用的優(yōu)勢。
[000引基于對可在干燥狀態(tài)下存活多年的極端微生物如緩步動物、輪蟲或面蟲（brine shrimp)的研究，有人假設(shè)可W在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中開發(fā)模擬運一分子現(xiàn)象的技術(shù)和方案。 遺憾的是，即使在數(shù)十年的研究之后，仍未實現(xiàn)細(xì)胞的實用干燥儲存穩(wěn)定化。所描述的最好 的穩(wěn)定化技術(shù)采用海藻糖一一一種非還原糖分子作為干燥介質(zhì)。載有海藻糖的哺乳動物細(xì) 胞可被干燥但需要幾乎立即再水化，并且即使那樣存活率仍然有限。已經(jīng)證明，干燥細(xì)胞儲 存即使持續(xù)幾分鐘也會導(dǎo)致徹底的細(xì)胞死亡。
[0006] 因此，存在開發(fā)允許細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本干燥儲存且再水化時保持活力的制 劑、組合物和方法的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本文所述的制劑、組合物和方法有利地使細(xì)胞在基本干燥的條件下儲存時維持存 活狀態(tài)，使得細(xì)胞在干燥儲存至少一小時，且在某些實施方案中至少一周的時間段后再水 化時保持至少一種功能性質(zhì)，例如，細(xì)胞活力，從而在無需冷凍或凍干的情況下顯著增加可 用于運輸和儲存活細(xì)胞的時間。在本發(fā)明的一個方面，提供了組合物，其包含在沒有冷凍或 任選地沒有凍干的情況下基本干燥儲存的細(xì)胞，其中該細(xì)胞在基本干燥儲存至少1小時后 再水化時，再水化的細(xì)胞表現(xiàn)出至少一種與脫水和基本干燥儲存之前的細(xì)胞基本相同的功 能性質(zhì)。
[0008] 在某些實施方案中，所述組合物包含至少一種干燥儲存穩(wěn)定劑，該干燥儲存穩(wěn)定 劑優(yōu)選地選自氨基酸、合成氨基酸、膚、非還原糖、馨合劑、水溶性聚合物和四氨喀晚。在一 個實施方案中，不存在為糖分子（例如，海藻糖）的穩(wěn)定劑，或者如果存在為糖分子的穩(wěn)定 劑，則還存在另一種不是糖分子的穩(wěn)定劑。
[0009] 在某些其他實施方案中，提供了包含至少一種調(diào)亡抑制劑、優(yōu)選可逆調(diào)亡抑制劑 的組合物。示例性的調(diào)亡抑制劑選自陽服-e IF2-a抑制劑、ASKl抑制劑、NRF2-KEAP1抑制劑、 JNK抑制劑、P38MAP激酶抑制劑、IREl抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑、PI3K通路抑制劑、巧 蛋白酶抑制劑W及脫天蛋白酶-1抑制劑。
[0010] 在另一個方面，提供了組合物，其中在脫水之前用包含至少一種調(diào)亡抑制劑的預(yù) 脫水制劑處理細(xì)胞W產(chǎn)生預(yù)處理的細(xì)胞。在某些實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑選 自PE服-eIF2-a抑制劑、ASKl抑制劑、NRF2-KEAP1抑制劑、JNK抑制劑、P38MAP激酶抑制劑、 IREl抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑、PI3K通路抑制劑、巧蛋白酶抑制劑W及脫天蛋白酶-1 抑制劑。
[0011] 在一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是PE服-eIF2-a抑制劑。
[0012] 在另一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是ASKl抑制劑。
[0013] 在又一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是NRF2-KEAP1抑制劑。
[0014] 在又一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是GSK3抑制劑。
[0015] 在一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是MEK抑制劑。
[0016] 在另一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是JNK抑制劑。
[0017] 在又一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是JNK抑制劑和P38MAP激酶抑制 劑。
[0018] 在又一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是PI3K抑制劑。
[0019] 在一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是IRE-I抑制劑。
[0020] 在另一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是巧蛋白酶抑制劑。
[0021] 在又一個實施方案中，所述至少一種調(diào)亡抑制劑是脫天蛋白酶-1抑制劑。
[0022] 在某些實施方案中，所述預(yù)脫水制劑包含至少一種調(diào)亡抑制劑和至少一種邸蛋白 伴侶誘導(dǎo)劑。
[0023] 在某些其他實施方案中，所述預(yù)脫水制劑包含至少一種調(diào)亡抑制劑和至少一種自 隧誘導(dǎo)劑。
[0024] 在又一個實施方案中，所述預(yù)脫水制劑包含至少一種調(diào)亡抑制劑和至少一種存活 蛋白。
[0025] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含再水化的細(xì)胞的組合物，其中該再水化的細(xì) 胞是在沒有冷凍或凍干的情況下基本干燥儲存的細(xì)胞，其中該細(xì)胞在基本干燥儲存至少1 小時后再水化時，該再水化的細(xì)胞表現(xiàn)出至少一種與脫水和基本干燥儲存之前的細(xì)胞基本 相同的功能性質(zhì)。
[0026] 在某些實施方案中，所述細(xì)胞的再水化在再水化制劑的存在下發(fā)生，并且優(yōu)選地 該再水化制劑包含至少一種調(diào)亡抑制劑。
[0027] 在某些其他實施方案中，所述再水化緩沖液中的至少一種調(diào)亡抑制劑選自PEW-e I F2-a抑制劑、ASK1抑制劑、NRF2-KEAP1抑制劑、JNK抑制劑、P38MAP激酶抑制劑、I RE 1抑制 劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑、PI3K通路抑制劑、巧蛋白酶抑制劑W及脫天蛋白酶-1抑制劑。
[0028] 在其他實施方案中，所述再水化制劑包含調(diào)亡抑制劑W及選自ER蛋白伴侶誘導(dǎo) 劑、自隧誘導(dǎo)劑和存活蛋白中的一種或多種。
[0029] 在一個實施方案中，再水化后的至少一種功能性質(zhì)包括代謝活性。
[0030] 在某些實施方案中，所述代謝活性通過測定ATP含量或脫天蛋白酶測定試驗來度 量。
[0031] 在某些其他實施方案中，再水化后的代謝活性在細(xì)胞再水化后24小時、細(xì)胞再水 化后48小時、細(xì)胞再水化后72小時或細(xì)胞再水化后一周測量。
[0032] 在其他實施方案中，所述組合物在再水化前W脫水形式穩(wěn)定化至少24小時，在再 水化前W脫水形式穩(wěn)定化至少48小時，在再水化前W脫水形式穩(wěn)定化至少72小時，或在再 水化前W脫水形式穩(wěn)定化至少一周。
[0033] 在其他方面，提供了脫水制劑，其包含抑緩沖液;合成氨基酸、水溶性聚合物；W及 第一氨基酸或膚。在某些實施方案中，所述脫水制劑進(jìn)一步包含非還原糖、至少一種調(diào)亡抑 制劑或第二氨基酸。
[0034] 在又一個方面，提供了在沒有凍干的情況下將一種或多種細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本 干燥儲存的方法，該方法包括:將一種或多種細(xì)胞在脫水制劑中溫育，W及在脫水制劑的存 在下使該一種或多種預(yù)處理的細(xì)胞脫水，W產(chǎn)生一種或多種基本干燥儲存的細(xì)胞。在其他 方面，提供了在沒有凍干的情況下將一種或多種細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本干燥儲存的方法， 該方法包括:將所述一種或多種細(xì)胞與包含調(diào)亡抑制劑的預(yù)脫水制劑一起溫育W產(chǎn)生一種 或多種預(yù)處理的細(xì)胞，去除所述預(yù)脫水制劑；W及在脫水制劑的存在下使所述一種或多種 預(yù)處理的細(xì)胞脫水，W產(chǎn)生一種或多種基本干燥儲存的細(xì)胞。
[0035] 在一個實施方案中，所述方法中使用的脫水制劑包含至少一種干燥儲存穩(wěn)定劑， 并且在沒有使用預(yù)脫水制劑時可進(jìn)一步包含至少一種調(diào)亡抑制劑(在一個實施方案中其為 可逆調(diào)亡抑制劑）。
[0036] 在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在將一種或多種細(xì)胞與所述預(yù)脫水制 劑一起溫育之前將所述一種或多種細(xì)胞固定至固體支持體上。
[0037] 在又一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括采用包含至少一種調(diào)亡抑制劑的再水 化制劑將所述一種或多種基本干燥儲存的細(xì)胞再水化，W產(chǎn)生再水化的細(xì)胞。
[0038] 在某些實施方案中，所述預(yù)脫水制劑中的至少一種調(diào)亡抑制劑與所述再水化制劑 中的至少一種調(diào)亡抑制劑相同，而在其他實施方案中，所述預(yù)脫水制劑中的至少一種調(diào)亡 抑制劑與所述再水化制劑中的至少一種調(diào)亡抑制劑不同。
【附圖說明】
[0039] 圖1是ER應(yīng)激通路的S種近端ER跨膜傳感器的示意圖，（A)GRP78結(jié)合的失活狀態(tài)， (B)GRP78的釋放導(dǎo)致激活I(lǐng)REl。
[0040] 圖2是邸應(yīng)激通路(A)、由調(diào)亡抑制劑抑制的ER應(yīng)激通路的阻斷步驟和祀標(biāo)(B)的 示意圖。
[0041] 圖3示出了采用本文所述的制劑和方法基本干燥儲存的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)保持 在再水化時分化成脂肪細(xì)胞(B圖）、骨細(xì)胞(C圖）和軟骨細(xì)胞(D圖）的能力。
[0042] 圖4示出了化La細(xì)胞在脫水和室溫下儲存5小時后的長期活力。（A)干燥5小時并隨 后進(jìn)行五天的再水化后的細(xì)胞活力。(B)每毫升的活細(xì)胞數(shù)目。將細(xì)胞接種到新鮮的細(xì)胞培 養(yǎng)板中，并采用根據(jù)本文公開的一個實施方案的組合物對各組進(jìn)行處理。
[0043] 圖5示出了相對于未處理的對照的脫天蛋白酶3/7活化。脫天蛋白酶活化計算為在 標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的測試樣品中的活性與未處理的細(xì)胞的活性之比。使測試的細(xì)胞 脫水并在室溫下干燥儲存5小時，隨后進(jìn)行5天的再水化。
[0044] 圖6示出了細(xì)胞在脫水、干燥狀態(tài)儲存7小時并且儲存后再水化后的存活。在重新 接種后3天W及再水化后共7天評價細(xì)胞活力。不同的穩(wěn)定化制劑影響細(xì)胞存活W及細(xì)胞增 殖。未受到保護(hù)的對照和海藻糖穩(wěn)定化的細(xì)胞沒有產(chǎn)生任何存活的細(xì)胞。 發(fā)明詳述
[0045] 不希望受任何理論的限制，預(yù)期本文所述的某些實施方案的制劑和組合物穩(wěn)定化 細(xì)胞膜和細(xì)胞的細(xì)胞器的完整性，同時還阻斷調(diào)亡(例如，通過在脫水前的限定階段和在再 水化時阻斷特定ER應(yīng)激通路），W提供在環(huán)境溫度下儲存至少一個小時的基本干燥的細(xì)胞， 該基本干燥的細(xì)胞在被再水化至少一小時的時間段后保持至少一種功能性質(zhì)。在某些實施 方案中，采用調(diào)亡抑制劑阻斷特定m?應(yīng)激通路。在其他實施方案中，采用調(diào)亡抑制劑結(jié)合ER 蛋白伴侶誘導(dǎo)劑來阻斷特定ER應(yīng)激通路，W驅(qū)使ER應(yīng)激通路朝向適應(yīng)性反應(yīng)而非調(diào)亡。
[0046] 在某些實施方案中，采用脫水制劑使細(xì)胞脫水，該脫水制劑優(yōu)選地包含至少一種 干燥儲存穩(wěn)定劑和至少一種調(diào)亡抑制劑。
[0047] 在某些其他實施方案中，在將細(xì)胞在脫水制劑的存在下脫水W產(chǎn)生基本干燥儲存 的細(xì)胞之前，采用包含調(diào)亡抑制劑的預(yù)脫水制劑預(yù)處理細(xì)胞預(yù)定的一段時間，例如1小時。 將基本干燥儲存的細(xì)胞在再水化制劑的存在下再水化，該再水化制劑優(yōu)選地包含調(diào)亡抑制 劑，該調(diào)亡抑制劑可與預(yù)脫水制劑中的調(diào)亡抑制劑相同或不同。在特定的一段時間，例如1 小時之后，去除再水化制劑，并且可根據(jù)預(yù)期的最終用途，將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基或其他合適 的溶液和緩沖液中再水化。 定義
[0048] 除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù) 人員通常理解的含義相同的含義。本文引用的所有專利、專利申請和出版物均通過引用全 文并入本文。
[0049] 如本文所用的，術(shù)語"真核細(xì)胞"是指在真核生物(優(yōu)選人類)的真核細(xì)胞發(fā)育的任 何給定階段(包括受精的卵母細(xì)胞、母細(xì)胞W及其他胚胎階段、胎兒或成人）的體液或組織 中存在的至少一種有核細(xì)胞?？刹捎帽景l(fā)明的制劑、組合物和方法在環(huán)境溫度下基本干燥 儲存的示例性細(xì)胞包括但不限于成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、黑素細(xì)胞、成骨細(xì) 胞、骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、屯、肌細(xì)胞、神經(jīng)元、雪旺細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、 T細(xì)胞、B細(xì)胞、記憶細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì) 胞、巨隧細(xì)胞、巨核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、膜島細(xì)胞、卵母細(xì)胞、精母細(xì)胞、胎盤廝帶血 細(xì)胞、母細(xì)胞、合子、上皮細(xì)胞(例如，乳腺細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、膜腺腺泡細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、朗 格漢斯細(xì)胞、成釉細(xì)胞和帕內(nèi)特細(xì)胞）、牙細(xì)胞(odontocytes)、肝細(xì)胞、脂細(xì)胞、壁細(xì)胞、肺 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、視網(wǎng)膜光感受器和色素細(xì)胞、晶狀體細(xì)胞W及干 細(xì)胞(包括多能或全能胚胎干細(xì)胞、胎兒干細(xì)胞、iPS細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞)或其混合物。干 細(xì)胞可WW未分化或部分分化狀態(tài)在環(huán)境溫度下基本干燥儲存。
[0050] 如本文所用的，術(shù)語"預(yù)處理的細(xì)胞"是指在脫水之前已經(jīng)用包含至少一種調(diào)亡抑 制劑的預(yù)脫水制劑處理過的細(xì)胞。預(yù)處理的細(xì)胞預(yù)先載有調(diào)亡抑制劑，W允許采用含有或 缺少調(diào)亡抑制劑的脫水制劑在沒有m?應(yīng)激通路活化的情況下基本干燥儲存預(yù)處理的細(xì)胞。 在某些實施方案中，在添加脫水制劑之前，將包含調(diào)亡抑制劑的預(yù)脫水制劑從預(yù)處理的細(xì) 胞中去除，但細(xì)胞內(nèi)調(diào)亡抑制劑的濃度足W在沒有邸應(yīng)激通路活化的情況下基本干燥儲存 細(xì)胞。
[0051 ]如本文所用的，術(shù)語"在環(huán)境溫度下基本干燥儲存"或"在環(huán)境溫度下基本干燥儲 存的"是指采用本發(fā)明的制劑、組合物和方法，在沒有冷凍或凍干的情況下將細(xì)胞在環(huán)境溫 度下儲存，同時使細(xì)胞在再水化狀態(tài)下保持至少一種功能性質(zhì)的能力?；靖稍飪Υ娴募?xì) 胞不一定需要消除所有的內(nèi)部自由水，但優(yōu)選去除至少45%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或最多98%的內(nèi)部自由水。根據(jù)待干燥儲存的細(xì)胞的 類型、所使用的預(yù)脫水和/或脫水制劑W及基本干燥儲存的細(xì)胞的預(yù)期用途，可將基本干燥 儲存的細(xì)胞在環(huán)境溫度下儲存不同的時間段?？蓪⒓?xì)胞W脫水狀態(tài)儲存W下的時間段：1) 數(shù)小時，例如，1、2、6、12或18小時；2)數(shù)天，例如，1天、2天、4天或6天;3)數(shù)周，例如，1周、2周 或3周;4)數(shù)月，例如，1個月、2個月、4個月、6個月、8個月或11個月；W及5)甚至數(shù)年，例如，1 年、2年、5年、10年、20年或更多年。
[0052] 如本文所用的，術(shù)語"固定的"是指粘附于固體表面或與固體表面直接接觸的基本 干燥儲存的細(xì)胞?？蓪⒓?xì)胞在添加脫水制劑和干燥之前固定，或可在預(yù)脫水步驟之前固定 并在整個脫水過程中保持固定。合適的固體表面包括但不限于:載玻片、珠子、忍片、膜、片、 網(wǎng)、柱、親和樹脂、海綿、塑料(包括96孔板）、培養(yǎng)皿和燒瓶、管、容器、器皿、天然基質(zhì)(諸如 但不限于膠原和藻酸鹽水凝膠)或細(xì)胞可W借其生長的任何其他基層。
[0053] 如本文所用的，"調(diào)亡抑制劑"是指能夠下調(diào)、減少、抑制或W其他方式調(diào)節(jié)所期望 的酶的量和/或活性或通路(優(yōu)選地在ER應(yīng)激通路中的步驟)W防止誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的任何化 合物或試劑，包括ER蛋白伴侶誘導(dǎo)劑、自隧誘導(dǎo)劑W及內(nèi)源或外源性存活蛋白。對運些酶或 通路的抑制可通過本領(lǐng)域已知的多種機(jī)制中的任何機(jī)制來實現(xiàn)，該機(jī)制包括但不限于:直 接與酶結(jié)合(優(yōu)選W可逆的方式），或者短暫地抑制編碼酶或祀標(biāo)的基因的表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)錄 成mRNA，翻譯成新生多膚，和/或最終多膚修飾成成熟蛋白質(zhì)）。調(diào)亡抑制劑包括本文所述的 具體的調(diào)亡抑制劑。
[0054] 如本文所用的，術(shù)語"抑制"是指化合物或試劑下調(diào)、減少、降低、抑制、滅活或至少 部分地抑制酶的活性或者酶或蛋白質(zhì)的表達(dá)的能力。優(yōu)選地，該抑制是可逆的。 ER應(yīng)激通路
[0055] 在某些實施方案中，所述預(yù)脫水制劑、脫水制劑和/或再水化制劑包含至少一種調(diào) 亡抑制劑，該調(diào)亡抑制劑阻斷ER應(yīng)激通路中的至少一個必要步驟。
[0056] 如圖IA所示，高等真核生物的未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)信號傳導(dǎo)通過S個近端邸 跨膜傳感器一陽服、激酶/RNA酶IRE巧日轉(zhuǎn)錄因子ATF6來引發(fā)(例如，參見Kaufman RJ(2002) J Clin Invest HO:1389-1398.doi:10.1172/jci0216886；Mori K(2000)Cell 101:451-454.doi:10.1016/s0092-8674(00)80855-7;Ron D，Walter P(2007)化t Rev Mol Cell Biol 8:519-529.(1〇1:10.1038/11^11219)。陽服的活化通過61的〇(〇翻譯起始因子）的憐酸化 導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯在整體范圍內(nèi)的抑制（圖lB;Harding等人，（2000)1〇10611 5:897-904.(1〇1:10.1016/31097-2765(00)80330-5)。與此相伴，陽服通過增加轉(zhuǎn)錄因子41。4的翻 譯促進(jìn)UPR特異性基因的轉(zhuǎn)錄。IRE1通過從XBP1 mRNA上切除內(nèi)含子產(chǎn)生選擇性剪接的更有 效形式的XBPl (例如，參見Calfon等人（2002)化ture 415:92-96. doi : 10.1038/415092a)。 第SUPR傳感器一ATF6，是一種ER跨膜蛋白質(zhì)，在其胞質(zhì)側(cè)上具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。
[0057] 如圖2A所示，在邸應(yīng)激事件中，ATF6經(jīng)歷蛋白質(zhì)水解，由此從邸膜釋放其胞質(zhì)反式 激活結(jié)構(gòu)域。一旦被釋放，該胞質(zhì)反式激活結(jié)構(gòu)域即進(jìn)入細(xì)胞核化aze等人，（1999)Mol Biol Cell 10:3787-3799.doi :10.1091/mbc. 10.11.3787)并啟動另外的UPR基因的轉(zhuǎn)錄。 由UPR引起的ER應(yīng)激的近端傳感器的活化導(dǎo)致復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)模式。因此IPR信號旨在通過 上調(diào)邸蛋白伴侶如BiP、GRP94、巧網(wǎng)蛋白和化dj4提高蛋白質(zhì)折疊能力來減輕和減少邸中高 水平的錯折疊蛋白質(zhì)（例如，參見Okada等人，（2002)Biochem J 366:585-594.doi: 10.1042/bj20020391;Yoshida等人，（1998)J Biol Chem 273:33741-33749.doi :10.1074/ jbc. 273.50.33741)。然而，在邸中的正確蛋白質(zhì)折疊無法得到恢復(fù)的事件中，基因如CHOP 被上調(diào)并可導(dǎo)致調(diào)亡通路的激活。 l.GRP78/BiP
[0058] GRP78/BiP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完整性和應(yīng)激誘導(dǎo)的自隧所需的分子蛋白伴侶HSP家族的成 員。GRP78在調(diào)節(jié)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)化PR)中起核屯、作用，并且是真核細(xì)胞中自隧的專性組 分，并可在細(xì)胞適應(yīng)和致癌存活中發(fā)揮重要作用。GRP78的一種客戶蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)雙鏈 RNA激活的蛋白樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PE服），并且其與陽服的結(jié)合阻止陽服寡聚。GRP78還與客戶 蛋白質(zhì)IREl和ATF6結(jié)合W防止IREl的寡聚和ATF6的活化。GRP78在促進(jìn)邸內(nèi)部多聚體蛋白 質(zhì)復(fù)合物的組裝中發(fā)揮作用。 2.IREl
[0059] 需要肌醇的酶I(IREl)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的ser/thr蛋白質(zhì)激酶。IREl在 作為對基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激信號的響應(yīng)而改變基因表達(dá)方面是重要的，并且通過其N末端結(jié) 構(gòu)域感測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的網(wǎng)眼中的未折疊蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致酶的自活化?；钚缘暮颂呛怂醿?nèi)切酶 結(jié)構(gòu)域?qū)BPlmRNA進(jìn)行剪接W產(chǎn)生新的C末端，從而將其轉(zhuǎn)化成有效的未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng) 轉(zhuǎn)錄激活因子并觸發(fā)生長停滯和調(diào)亡。激酶結(jié)構(gòu)域通過反式自憐酸化而得到激活，并且激 酶活性對于核糖核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的活化是必需的。IREl被廣泛表達(dá)且在膜腺組織中觀察 到其高水平。IREl是二硫鍵連接的同二聚體，且二聚體形成由N末端腔結(jié)構(gòu)域內(nèi)的疏水作用 驅(qū)動并通過二硫鍵而穩(wěn)定化。IREl還與HSPA5(未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)物)結(jié)合。該相互 作用可破壞同二聚體化作用并阻止IREl的激活。 3. 陽服
[0060] 真核生物翻譯起始因子2-a激酶3，也稱為P服R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶或蛋白質(zhì)激酶R(PKR) 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PE服），是一種在人類中由EIF2AK3基因編碼的酶。PE服對真核生物翻譯起始 因子2化IF2)的a亞基進(jìn)行憐酸化，導(dǎo)致其失活，并由此導(dǎo)致翻譯引發(fā)的快速減少和對總體 蛋白質(zhì)合成的抑制。它是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)化R)中的I型膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中它通過由錯折疊蛋白 質(zhì)導(dǎo)致的ER應(yīng)激而得到誘導(dǎo)。 4. ATF6
[0061] 運種基因編碼在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)化R)應(yīng)激過程中激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)的祀基因的 轉(zhuǎn)錄因子。雖然它是轉(zhuǎn)錄因子，但運種蛋白質(zhì)是不常見的，因為它作為嵌入ER中的跨膜蛋白 質(zhì)而合成。它起到邸應(yīng)激傳感器/轉(zhuǎn)導(dǎo)器的作用