h 90% )
[0289] K85-EE 和 K85-FA
[0290] 預(yù)濃縮物A-E的制備如表18所示。
[0291] 表18:預(yù)濃縮物A-E
[0292]

[0293] 脂解的通常程序
[0294] 體外動(dòng)態(tài)脂解模型是Zangenberg等人開(kāi)發(fā)的（Zangenberg，N. H.等人，已111\ J. Pharm. Sci. 14, 237-244, 2001 ;Zangenberg，N. H.，等人，Eur. J. Pharm. Sci. 14,115-122， 2001)，使用中略微做了修改。脂解是在恒溫的600ml夾套玻璃容器中在豬膽汁提取物的 存在下進(jìn)行的，并伴隨氯化鈣的持續(xù)加入。脂肪酶的來(lái)源是豬胰酶，并且在水解之后用pH Stat法用氫氧化鈉溶液（1. ON)進(jìn)行滴定（pH 6. 5)。脂解介質(zhì)的初始組成見(jiàn)表19。
[0295] 表19 :脂解介質(zhì)的初始組成
[0296]
[0297] 所有實(shí)驗(yàn)的終體積為300ml，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的媽分散速率（dispensing rate)為 0. 045mmol/分鐘（0. 09ml/分鐘）。所有實(shí)驗(yàn)中，加入K85-EE的量對(duì)應(yīng)于5. 58mg/ml。
[0298] 為通過(guò)HPLC測(cè)定K85-EE脂解的進(jìn)程，取出粗制樣品并用稀鹽酸酸化。用HPLC - 式三份測(cè)定了 EPA-EE、DHA-EE、EPA-FA和DHA-FA的濃度。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的條件如下：LC Agilent Technologies 1200 系列儀器，柱溫為 30°C，流動(dòng)相：(A)水（0? 1% 乙酸）和（B)MeCN(O. 1% 乙酸），梯度：〇至8分鐘，70% B至100% B ;8至15分鐘，100% B ;15至16分鐘：100% B 至70%B，16至20分鐘：70%B。流速為0. 5ml/分鐘，UV在210納米，進(jìn)樣體積：5yl，運(yùn) 行時(shí)間：20分鐘。
[0299]隨時(shí)間監(jiān)控EPA乙酯（EPA-EE)、DHA乙酯（DHA-EE)、EPA游離酸（EPA-FA)和DHA 游離酸（DHA-FA)的濃度，計(jì)算脂解速率如表20所示，以與Omacor?對(duì)比。
[0300] 表20 :EPA乙酯和DHA乙酯與Omacor?的脂解對(duì)比
[0301]
[0302] 圖19、22、25、28、31和34圖示了在每個(gè)分別的檢測(cè)樣品脂解的過(guò)程中EPA-EE和 DHA-EE的消失以及EPA-FA和DHA-FA的出現(xiàn)。圖中包括了從2分鐘到233分鐘的取樣點(diǎn)。 另外，包括了線性回歸線。
[0303] 圖20、23、26、29、32和35提供了對(duì)于每個(gè)分別的檢測(cè)樣品在不同時(shí)間點(diǎn)EPA+DHA 的百分回收率。數(shù)據(jù)以EPA-EE、DHA-EE、EPA-FA和DHA-FA的總和給出，并以理論量5580 y g/ ml的百分比給出。
[0304] 圖21、24、27、30、33和36圖示了在不同時(shí)間點(diǎn)EPA-EE、DHA-EE和總K85EE的百分 脂解率。相對(duì)于用HPLC在脂解2分鐘后測(cè)定的EPA-EE和DHA-EE的總量而計(jì)算數(shù)值。
[0305] 實(shí)施例6 :藥物組合物/預(yù)濃縮物的脂肪酸油混合物
[0306] 藥物組合物或預(yù)濃縮物的脂肪酸油混合物，其中所述脂肪酸油混合物為K85-EE 組合物，如表21所示。
[0307] 表21:藥物組合物/預(yù)濃縮物的脂肪酸油混合物
[0308]
[0309] EE =乙酯
[0310]實(shí)施例7:片劑制劑
[0311] 通過(guò)將表22所示的片劑浸入K85EE油制備片劑。平均液體負(fù)載量為160mg油/ 片劑，對(duì)應(yīng)于約72v/v%。所述片劑還可不加超級(jí)崩解劑制備。
[0312] 表22:片劑制劑
[0313]
[0314] 實(shí)施例8:新的K85片劑制劑
[0315] 使用表23鑒定的成分通過(guò)將片劑浸入K85EE或AGP油和以游離酸形式的油中制 備片劑制劑。
[0316] 表23:K85片劑制劑
[0317]
[0318] 實(shí)施例9 :SEDDS和SMEDDS的制備
[0319] 通過(guò)將脂肪酸油混合物與至少一種表面活性劑和一種游離脂肪酸混合制備預(yù)濃 縮物。
[0320] 在混合后目測(cè)檢查所述預(yù)濃縮物，并在室溫保存24小時(shí)后再次目測(cè)檢查，且可獲 得澄清和透明的預(yù)濃縮物。
[0321] 然后可向所述預(yù)濃縮物中加入水性介質(zhì)，形成水包油乳劑。形成水包油乳劑的分 散速率可非常迅速，低于一分鐘。
[0322] 然后，可以測(cè)試形成的微乳劑的水解，或稱(chēng)為脂解。
[0323] 例如，為了通過(guò)HPLC測(cè)定KE85-EE水解的過(guò)程，可以取出粗品并用稀鹽酸酸化。然 后可通過(guò)HPLC測(cè)定EPA乙酯、DHA乙酯、EPA游離脂肪酸和DHA游離脂肪酸的濃度。
[0324] 從非均勻相中取出所有樣品，并預(yù)期回收率的一些變化，尤其在較早時(shí)間點(diǎn)。
[0325] 表24:在水解介質(zhì)中的成分的開(kāi)始濃度
[0326]
[0327] HPLC分析方法的實(shí)例可包括以下參數(shù)：
[0328]使用 Agilent Technologies 生產(chǎn)的 LC-MS，其包括 1200Series LC 和 6140Quadropole MS，運(yùn)行 ChemStation B. 04. 01 軟件；
[0329]柱：EclipseXDB C18, 2. lX150mm，5 y m，Agilent
[0330]柱溫：25°C ;
[0331]流動(dòng)相：A:水（0?1% 乙酸），B:MeCN(0. 1% 乙酸）；
[0332]梯度：0 至 8 分鐘：70% B 至 100% B，8 至 15 分鐘：100% B，15 至 16 分鐘：100% B 至 70% B，16 至 20 分鐘：70% B ;
[0333]流速：0? 5ml/分鐘；
[0334] UV 在210nM;
[0335] 進(jìn)樣量：25 yl;和
[0336] 運(yùn)行時(shí)間：20分鐘。
[0337] 然后可進(jìn)一步分析所述水包油乳劑以測(cè)定油滴的粒度。使用Malvern zetasizer 粒度儀（粒度測(cè)量范圍為〇. 5_6000nm且（電位顆粒范圍為3nm_10 y m) (Malvern Instrument，Worcestershire，UK)測(cè)定粒度。
[0338] 表25顯示可包括在本發(fā)明公開(kāi)的藥物組合物和食品補(bǔ)充劑組合物中的成分。
[0339] 表25 :本發(fā)明公開(kāi)的樣品組合物
[0340]
[0341] 又例如，K85EE?-3脂肪酸油和選自K85FA的游離脂肪酸（該K85FA具有的 EPA:DHA-FA比近似等于K85EE中的EPA:DHA-EE比）在表26中例示。
[0342] 表26 :本發(fā)明公開(kāi)的其它組合物
[0343]
[0344] CN104958275A 說(shuō)明書(shū) 45/59 頁(yè)
[0345] 此外，如上所述的總油混合物可以與表面活性劑Tween?20浞合。
[0346] 又例如，所述K85EE混合型脂肪酸組合物包含至少90%的《 -3脂肪酸乙酯，且其 中所述混合型脂肪酸組合物包含以脂肪酸組合物的重量計(jì)約80%至約88%的二十碳五烯 酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯。
[0347][油]:[表面活性劑]:[游離脂肪酸](a) :b) : c))之間的比例的集合示于表27中。 例如，K85EE或AGP103油以[K85EE]:[表面活性劑]:[游離脂肪酸]的范圍為約4:2:0. 5 至4:4:2與表面活性劑和輔助表面活性劑一起使用。因此，表面活性劑的范圍可為2至4 且所述游離脂肪酸的范圍為〇. 5至2。
[0348] 此處還涉及：表27所示的K85EE油混合物可以被以乙酯和/或甘油三酯形式的 K85TG油混合物以及市售《-3油濃縮物替換。
[0349]表27 :具有Tween20、K85EE、EPA-FA 或 DHA-FA 的 SMEDDS 制劑
[0350]
[0351] 實(shí)施例10 :藥物預(yù)濃縮物組合物
[0352] 通過(guò)混合以下成分制備藥物預(yù)濃縮物組合物：
[0353] 作為所述脂肪酸油混合物：K85-EE;量為10. 80g;
[0354] 作為所述表面活性劑：Tween_20 (分子生物學(xué)級(jí)，AppliChem Darmstadt， A4974, 0250 lot 5N004174)，量為 7. 44g ;
[0355] 作為所述至少一種脂肪酸：EPA-FA，量為1. 53g;和DHA-FA，量為1. 24g。
[0356] 伴隨混合，獲得了透明均勻的溶液。所述制劑的密度測(cè)定為1.02g/ml。然后將所 述組合物填充至瓶（瓶大小=4ml)中，各包括1.25x 1670mg = 2087mg，充入氮?dú)獠⒂檬€ 密封。
[0357] 實(shí)施例11:在小型豬中的體內(nèi)研宄
[0358] 制備了兩種不同制劑并送至體內(nèi)測(cè)試。制劑1根據(jù)實(shí)施例10,通過(guò)將指定量的以 下成分混合而制備：K85EE、Tween20EPA-FA和DHA-FA，且制劑2為0MAC0R明膠膠囊。
[0359]所述研宄在8 只來(lái)自Ellegaard G6ttingen Minipigs ApS 的雄性Gdttingen SPF小型豬中進(jìn)行。將動(dòng)物單獨(dú)圈養(yǎng)于含有鋸肩（"Jeluxyl"，來(lái)自Jelu Werk GmbH，J〇Sef Ehrler GmbH&Co KG，Ludwigsmilhle，D-73494Rosenberg，Germany)作為墊料的畜舍（floor pens) (1. 2m2)中。
[0360] 以交叉設(shè)計(jì)進(jìn)行治療。劑量為2g/動(dòng)物。治療的第一天指定為Day 1。以各次給 藥之間留出至少10天的間歇期進(jìn)行治療。給藥后采集血樣（n = 8)。通過(guò)經(jīng)確證的LC-MS/ MS方法在2周內(nèi)分析血漿樣品的EPA和DHA的總脂質(zhì)含量。示于圖37的結(jié)果顯示EPA的 總脂質(zhì)濃度的血漿濃度-時(shí)間曲線，支持了 K85 SMEDDS制劑的上述生物利用度（例如，超 過(guò)40%)。DHA的總脂質(zhì)濃度的時(shí)間曲線顯示了相似結(jié)果（圖37中未顯示）。
[0361] 實(shí)施例12:藥物制劑、SMEDDS和SEDDS
[0362] 表28例示了可以制備的藥物制劑、SMEDDS和SEDDS。
[0363]表 28:藥物制劑、SMEDDS、SEDDS
[0364]
[0365] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表面活性劑選自Tween?表面活性劑，例如Tween? 20、40、60、80和85。例如，本發(fā)明公開(kāi)的組合物可包含至少一種選自Tween?20和40的 表面活性劑。
[0366] 實(shí)施例13:乳劑/微乳劑預(yù)濃縮物制劑
[0367] 制備本發(fā)明公開(kāi)的以下乳劑/微乳劑預(yù)濃縮物制劑。
[0368] 藥物制劑1 :SEDDS組合物
[0369] 通過(guò)混合以下成分制備藥物組合物：脂肪酸油混合物a)EPA_FA，量為5. 5g，和 DHA-FA，量為4. 5g (大約達(dá)到K85EE或FA脂肪酸混合物中的EPA:DHA比例）；b)以EE形式 的第二脂肪酸混合物：油酸乙酯：Fluka75100,137044 50308P14,量為5. 0g ;以及表面活性 劑 c):Tween?20,分子生物學(xué)級(jí)，AppliChem Darmstadt，A4974,0250 lot 5N004174,量 為 l〇.〇g。
[0370] 獲得了透明均勻的溶液。所述制劑的密度測(cè)定為1. 03g/ml。然后將所述組合物填 充至瓶（瓶大小=4ml)中，各包括（2450mg X 1.25) = 3063mg，充入氮?dú)獠⒂檬€密封。
[0371] 藥物制劑2
[0372] 用Tween?80替代Tween?20,如上所述制備相同制劑。因此該制劑成分為： 混合型脂肪酸；EPA-FA(110mg)+DHA-FA(90mg)、油酸乙酯（100mg)和 Tween 80(200mg)。獲 得透明均勻的溶液。
[0373] 實(shí)施例14:純水中的乳劑
[0374] 在閃爍瓶中將一粒Omacor?膠囊的油性?xún)?nèi)容物（含有EPA乙酯（465mg)、DHA乙 酯（375mg)和a-生育酚（4mg))與表29所示的多種表面活性劑相混合。在37攝氏度加 入水（10ml)并且用渦旋混合器將混合物振蕩15秒。在1分鐘和5分鐘后觀察該混合物。 乳劑均勻性的目測(cè)評(píng)分如下：無(wú)乳化=〇分，乳化但不是均勻乳化=1分，均勻乳化=2分。
[0375] 混合后的所述混合物還在滾軸混合器中滾動(dòng)5分鐘。滾動(dòng)試驗(yàn)的目測(cè)評(píng)分與上面 相同。
[0376] 表29:純水中的乳劑
[0377]
[0378]
[0379] 實(shí)施例15 :人工胃液中的乳劑
[0380] 在閃爍瓶中將一粒OMACOR'?膠囊的油性?xún)?nèi)容物（含有EPA乙酯（465mg)、DHA 乙酯（375mg)和a-生育酚（4mg))與表30所示的多種表面活性劑相混合。除了用無(wú)胃蛋 白酶的人工胃液（歐洲藥典6.0,274頁(yè)）代替水之外，實(shí)驗(yàn)設(shè)置與實(shí)施例14所述相同。
[0381] 表30:人工胃液中的乳劑
[0382]
[0383] 實(shí)施例16 :模擬腸液中的乳劑
[0384] 在閃爍瓶中將一粒Omac〇r?J狡囊的油性?xún)?nèi)容物（含有EPA乙酯（465mg)、DHA乙 酯（375mg)和a-生育酚（4mg))與表31所示的多種表面活性劑相混合。除了用pH 6.8 的無(wú)胰腺粉末的模擬腸液（歐洲藥典6. 0, 274頁(yè)）代替水之外，實(shí)驗(yàn)設(shè)置與實(shí)施例14所述 相同。
[0385] 表31:模擬腸液中的乳劑
[0386]
[0387] 實(shí)施例17 :乳劑的顯微鏡檢查
[0388] 滾動(dòng)24小時(shí)后，在顯微鏡下檢查實(shí)施例15的參考編號(hào)52 (胃液）和實(shí)施例16的 參考編號(hào)58 (腸液）的乳劑。發(fā)現(xiàn)這兩種乳劑為水包油的混懸液，沒(méi)有凝聚的趨勢(shì)。
[0389] 實(shí)施例18 :藥用制劑
[0390] 表32中的實(shí)施例示例了可制備的藥用制劑。
[0391] 表32:藥用制劑
[0392]
[0393]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表面活性劑或表面活性劑的組合選自Tween?表面活 性劑；Tween?20、Tween?40、Tween?60、Tween?65、Tween?(so 和Tween? 85〇
[0394]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述表面活性劑選自以下組合：Tween?表面活性劑和選 自Cremophor?的表面活性劑，例如Tween? 20和Cremophor EL。另外，在另一個(gè)實(shí)施方 式中，Tween?:20和Solutol HS 15表面活性劑可以一起使用，Tween?20和Tween?' 40也可以一起使用。
[0395]藥物預(yù)濃縮物的脂肪酸油混合物（所述脂肪酸油混合物為K85EE或AGP-103油性 組合物）如表33所示。
[0396] 表33 :用于藥物預(yù)濃縮物的脂肪酸油混合物
[0397]
[0398] EE =乙酯
[0399] 實(shí)施例19 :人工胃液和模擬腸液中的其它乳劑
[0400] 預(yù)濃縮物1-23是用EPA/DHA乙酯（lOOOrng K85EE)與多種表面活性劑和表面活性 劑混合物制備的，如表34所示。乳劑在胃液和模擬腸液中制備，如實(shí)施例15和16所述。在 人工胃液和模擬腸液中的乳劑結(jié)果相同，如表34所不。
[0401] 表34 :人工胃液和模擬腸液中的乳劑
[0402]
L0403」 仕人丄胃m利悮擬腸淞甲制爸的乳刑4-lb仕靜置町俅狩均(乳狀）右十小町。 乳劑1-3在制備后（即靜置若干小時(shí)后）一定程度地分層。乳劑1-15的顯微檢查顯示，平 均粒徑小于100微米。乳劑4均一化處理（UltraRurrax (IKA)) 20秒導(dǎo)致形成的小顆粒顯 著增多（〈10微米）。
[0404] 基于制備的預(yù)濃縮物，0. 5%的非離子型表面活性劑（例如Cremophor?)能在人 工胃液和模擬腸液中乳化EPA/DHA乙酯。另外，包括多于一種的表面活性劑表現(xiàn)出能使乳 劑穩(wěn)定。此外，粒徑可根據(jù)乳化方法而不同。
[0405] 實(shí)施例20:用鄰苯二甲酸醋酸纖維素包衣的明膠膠囊
[0406] (A)包括EPA乙酯和DHA乙酯的用鄰苯二甲酸醋酸纖維素包衣的明膠膠囊
[0407] 將包含EPA乙酯和DHA乙酯（Omacor?,Pfizer，Norway)的預(yù)形成明膠膠囊用 鄰苯二甲酸醋酸纖維素（6% )和檸檬酸三乙酯（3% )的丙酮溶液包衣。將所述膠囊在室 溫干燥24小時(shí)。包衣材料（鄰苯二甲酸醋酸纖維素加檸檬酸三乙酯）將每個(gè)膠囊的重量 增加15mg。
[0408] (B)包括EPA乙酯、DHA乙酯和Brij? 96V的用鄰苯二甲酸醋酸纖維素包衣的明膠 膠囊
[0409]將包含EPA乙酯（463mg)、DHA乙酯（375mg)、Brij? 96V(60mg)和生育酚（4mg) 的預(yù)形成明膠膠囊用鄰苯二甲酸醋酸纖維素（6% )和檸檬酸三乙酯（3% )的丙酮溶液包 衣。將所述膠囊在室溫干燥24小時(shí)。
[0410] 實(shí)施例21:用Eudragit?RS30D包衣的明膠膠囊
[0411] (A)包括EPA乙酯和DHA乙酯的川Eudragit?RS30D包衣的明膠膠囊
[0412] 將包含EPA乙醋和DHA乙醋（Omacor?,HizenNorway)的預(yù)形成明膠膠囊用 來(lái)自Degussa，Germany的Euragit?RS30D的水溶液包衣。將所述膠囊在室溫干燥24小 時(shí)。
[0413] ⑶包括EPA乙酯、DHA乙酯和Brij? 96V的用Eudragit?RS30D包衣的明膠膠 曩
[0414]將包含EPA乙酯（463mg)、DHA乙酯（375mg)、Brij? 96V(60mg)和生育酚（4mg) 的預(yù)形成明膠膠囊用來(lái)自Degussa，Germany的Euragit1?RS30D的水溶液包衣。將所述膠 囊在室溫干燥24小時(shí)。
[0415] 實(shí)施例22:腸溶衣片劑
[0416] 制備包衣片劑并給予動(dòng)物模型（小型豬）以測(cè)量EPA和DHA隨時(shí)間的血清濃度。
[0417] 兩種片劑如下預(yù)處理：
[0418]片劑 31 :20%PEG，10%Ac-Di-Sol(崩解劑）
[0419]片劑 32 :20%PEG，0. 5MKH2P04,10%Ac-Di-Sol(崩解劑）
[0420] 在流化床中進(jìn)行預(yù)處理，其中在流化床中將溶液噴灑至Neusilin顆粒，然后通過(guò) 加熱和/或壓縮所述顆粒并在氮?dú)庀卤剡^(guò)夜，然后用K85EE油負(fù)載。
[0421] 用水溶液PVA底層包衣（Opadry?II)的內(nèi)層和水溶性腸溶衣（Acyl EZE(Eudragit?L100-55腸溶衣）的外層包衣片劑。
[0422]EPA血清濃度的結(jié)果如表35所示，并在圖38中例示。DHA血清濃度的結(jié)果如表36 所示，并在圖39中例示。
[0423] 表35 :EPA血清濃度
[0424]
[0425] **AUC數(shù)據(jù)未經(jīng)基線校正。
[0426] 表36 :DHA血清濃度
[0427]
[0428] **AUC數(shù)據(jù)未經(jīng)基線校正。
[0429] 本發(fā)明公開(kāi)的片劑可用選自K85EE油+FFA+至少一種表面活性劑（例如Tween? 20或Tween?80)、K85FA油+至少一種表面活性劑和K85EE+至少一種表面活性劑的預(yù)濃 縮物預(yù)先負(fù)載。
[0430] 本申請(qǐng)涉及以下方面：
[0431] 1.以明膠膠囊或片劑形式的藥物組合物，其包含：
[0432] 脂肪酸油混合物，其包含以所述脂肪酸油混合物的重量計(jì)至少75%的二十碳五烯 酸（EPA)和二十二碳六烯酸（DHA)，其中所述EPA和DHA為選自乙酯和甘油三酯的形式；和
[0433] 至少一種游離脂肪酸；
[0434] 其中所述明膠膠囊或片劑包括至少一種包衣。
[0435]2. 1的組合物，其中所述至少一種包衣選自腸溶衣、底層、頂層，及其組合。
[0436] 3. 2的組合物，其中所述明膠膠囊包括至少一種腸溶衣。
[0437] 4. 2的組合物，其中所述明膠膠囊包括至少一種腸溶衣和在所述腸溶衣之上的至 少一種頂層。
[0438] 5. 2的組合物，其中所述明膠膠囊包括至少一種腸溶衣和在所述明膠膠囊壁與所 述腸溶衣之間的至少一種底層。
[0439] 6. 5的組合物，其中所述至少一種底層包含密封劑。
[0440] 7. 5的組合物，其中所述明膠膠囊在所述腸溶衣之上還包括至少一種頂層。
[0441] 8. 2的組合物，其中所述片劑包括至少一種腸溶衣。
[0442] 9. 2的組合物，其中所述片劑包括至少一種腸溶衣和在所述腸溶衣之上的至少一 種頂層。
[0443] 10. 2的組合物，其中所述片劑包括至少一種腸溶衣和在所述片劑表面和所述腸溶 衣之間的至少一種底層。
[0444] 11. 10的組合物，其中至少一種底層包含密封劑。
[0445] 12. 10的組合物，其中所述片劑在所述腸溶衣之上還包括至少一種頂層。
[0446] 13. 1的組合物，其中所述至少一種包衣包含至少一種選自明膠、成膜劑、聚合物， 以及共聚物的材料。
[0447] 14. 1的組合物，其中所述至少一種包衣包含至少一種以下的材料：明膠、甲基