一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種負載移植性神經(jīng)干細胞的 PF-127-LV-NFcocktail復合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 針對脊髓損傷急性期的治療主要是激素和傳統(tǒng)手術治療，但這些療法對脊髓損傷 所繼發(fā)引起的多種神經(jīng)功能障礙并無明顯效果。脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展往往與損傷后神經(jīng)細 胞的死亡以及與之相聯(lián)系的投射神經(jīng)元的進行性萎縮有關，其癥狀主要是因損傷導致大量 神經(jīng)細胞缺失，以及神經(jīng)網(wǎng)絡連接被破壞引起神經(jīng)傳遞中斷的結果。脊髓損傷后即使有一 定程度的軸突再生，其再生能力也極其有限，越來越多的證據(jù)顯示，內源性神經(jīng)發(fā)生不足以 修復損傷脊髓功能。修復脊髓損傷意味著神經(jīng)網(wǎng)絡組織結構在形態(tài)和功能兩方面的修復： 其目標在于重建神經(jīng)通路連接并恢復一定程度的功能。因此，修復的策略重點在于替代在 疾病過程中失去的神經(jīng)細胞并促使神經(jīng)生長，再建損傷后神經(jīng)軸突與其靶器官及投射神經(jīng) 元聯(lián)系，引導脊髓功能改善恢復?；诖?，目前認為細胞替代療法是治療脊髓損傷富有潛力 的策略。
[0003] 神經(jīng)干細胞（neuralstemcells，NSCs)理論上是治療脊髓損傷的首選細胞，是移 植替代治療的首選干細胞類型。許多學者嘗試應用神經(jīng)干細胞移植對脊髓損傷動物模型進 行研宄，并取得了一定的效果。國內也有多家綜合實力雄厚的醫(yī)院開展了初步的神經(jīng)干細 胞移植治療脊髓損傷等。但實踐中觀察到，脊髓損傷后移植的外源性神經(jīng)干細胞在受損脊 髓病理微環(huán)境存活較少，可觀察到移植細胞向神經(jīng)元分化，但這種分化神經(jīng)元的數(shù)目通常 較少，且移植的神經(jīng)干細胞絕大多數(shù)分化成星形膠質細胞。這種移植細胞存活少且傾向于 分化為星形膠質細胞而非神經(jīng)元的嚴重偏向是目前神經(jīng)干細胞移植替代療法的主要障礙 之一。因此，使用神經(jīng)干細胞移植治療脊髓損傷的一個關鍵問題是如何改善移植后神經(jīng)干 細胞所處的損傷局部病理微環(huán)境，增加移植的神經(jīng)干細胞存活生長，并使其盡可能多的定 向分化為脊髓神經(jīng)元。
[0004] 研宄發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，髓鞘和膠質瘢痕釋放的髓磷脂相關抑制因子是脊髓損 傷后局部微環(huán)境中主要的抑制因素。目前發(fā)現(xiàn)的髓磷脂相關抑制因子主要包括軸突生 長抑制因子（neuriteoutgrowthinhibitoryA，NogoA)、髓磷脂相關糖蛋白（myelin-associatedglycoprotein,MAG)和少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte myelinglycoprotein,OMgp)。這些抑制因子可與神經(jīng)細胞膜上的一種共受體成分-- LINGO-1(LRRandIgdomain-containingNogoreceptorinteractingprotein)結 合。LINGO-1選擇性表達在腦和脊髓的神經(jīng)元和少突膠質細胞上，是細胞膜上NgRl/p75/ LLNG0-1或NgRl/Troy/LING0-1信號轉導復合物的必要成分。髓磷脂抑制因子與LING0-1 結合后，引起其信號復合物活化，通過激活RhoA激酶將下游抑制信號轉導入神經(jīng)元和少突 膠質細胞內，從而抑制中樞神經(jīng)軸突生長和髓鞘形成。因此，LING0-1的發(fā)現(xiàn)為改善脊髓損 傷后的抑制環(huán)境提供了新的途徑，即通過靶向抑制LINGO-1基因表達，減少其與損傷微環(huán) 境中抑制因子的結合，并阻滯其下游信號的傳導而促進神經(jīng)生長。研宄表明，拮抗LING0-1 對脊髓損傷后神經(jīng)再生和功能恢復有明顯效應。
[0005] 進一步的研宄發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞同樣表達LING0-1分子，拮抗LING0-1的表達可增 加神經(jīng)干細胞的增殖，并使體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞定向神經(jīng)元分化。
[0006] 神經(jīng)干細胞移植的另一個障礙是經(jīng)胰蛋白酶處理的移植神經(jīng)干細胞以細胞懸浮 液形式直接移植入脊髓橫斷損傷部位后，多數(shù)只能存活在橫斷病灶邊緣而不能均勻填充橫 斷損傷的裂隙，造成分化后神經(jīng)元的軸突延伸只能部分橋接損傷區(qū)域。因此，亟待有能均勻 負載神經(jīng)干細胞并填充損傷裂隙的支撐物，該支撐物還應能滿足神經(jīng)干細胞分化后神經(jīng)軸 突延伸生長的需要，并能降解吸收，有良好的脊髓組織相容性等。近年來日益令人矚目的新 型人工合成的智能生物材料PluronicF-127(PF-127)水凝膠恰好能滿足這些要求。PF-127 是一種溫度敏感型水凝膠，它在〇°C左右為液態(tài)，而在37°C左右可由液態(tài)膠化轉變?yōu)閺椥?凝膠態(tài)，能起到遞送、釋放藥物和生物分子的運載系統(tǒng)以及生物支架的雙重作用。PF-127已 經(jīng)美國FDA批準在人類使用，其生物相容性好，可生物降解吸收。有研宄使用PF- 127在動 物體內構建組織工程軟骨和肺，其在脊髓損傷中的應用已有報道，并可在體外作為脂肪干 細胞、骨髓間充質干細胞等種子干細胞三維立體培養(yǎng)的生物支架。PF-127在體內溫度環(huán)境 下膠化后內部形成三維孔洞，可為神經(jīng)干細胞黏附、生長、增殖、分化及神經(jīng)軸突延伸及突 觸形成提供有利條件。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種能負載移植性神經(jīng)干細 胞、并能促進神經(jīng)干細胞定向分化和神經(jīng)再生的的PF-127-LV-NFcocktail復合物。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供能負載移植神經(jīng)干細胞、并能 促進神經(jīng)干細胞定向分化和神經(jīng)再生的PF-127-LV-NFcocktail復合物的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的目的之三在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供PF-127-LV-NFcocktail復合 物在促進移植性神經(jīng)干細胞定向分化和存活中的應用。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的之一，本發(fā)明采用如下技術方案： 提供一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復合物，它包括以下組份：PluronicF-127水凝膠、完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基、Lingo-1shRNA慢病毒表達載體和神經(jīng)生 長因子混合物； 所述神經(jīng)生長因子混合物由以下組份組成：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、 血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和膠 質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
[0011] 所述PluronicF-127水凝膠與所述完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基的混合比例為每 100mL完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中加入15g~25g的PluronicF-127水凝膠； 所述PluronicF-127水凝膠與所述神經(jīng)生長因子混合物的質量比為15~25:10~20 ; 所述Lingo-1shRNA慢病毒表達載體在所述PluronicF-127水凝膠和所述完全神經(jīng) 干細胞培養(yǎng)基混合后得到的混合液中的滴度為1X107TU/ml~4X107TU/ml。
[0012] 所述神經(jīng)生長因子混合物中，所述腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、所述神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、所 述血小板源性生長因子、所述胰島素樣生長因子1、所述表皮生長因子、所述堿性成纖維細 胞生長因子和所述膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合質量比為3~7:3~7:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5。
[0013] 所述完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基是通過往DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入胎牛血清、堿性成 纖維細胞生長因子、青霉素和鏈霉素配制而成。
[0014] 所述Lingo-1shRNA慢病毒表達載體的基本特征如下： ReporterGene:GFP CloningSiteat5' ：BamHICloningSiteat3' ：EcoRI HairpinLoopSequence:TCAAGAG TargetSize: 19mers〇
[0015] 為了實現(xiàn)上述目的之二，本發(fā)明采用如下技術方案： 提供一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復合物的制備方法，它包 括以下步驟： 步驟一，PluronicF-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基：在一定溫度下，并在攪 拌的狀態(tài)下，將配方量的PluronicF-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng) 基中，然后繼續(xù)攪拌一定時間，得到混合液，然后將混合液在一定溫度下靜置一定時間后， 得到半透明液態(tài)物； 步驟二，加入Lingo-1shRNA慢病毒表達載體：在一定溫度下，將Lingo-1shRNA慢 病毒表達載體與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有IX107TU/ ml~4X107TU/ml的Lingo-1shRNA慢病毒表達載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混 合液； 步驟三，加入神經(jīng)生長因子混合物：在一定溫度下，將配方量的神經(jīng)生長因子混合物加 入到步驟二得到的第二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液； 步驟四，過濾除菌：將步驟三得到的第三混合液用一定孔徑的微孔過濾器進行過濾除 困后，即得到PF_127_LV_NFcocktail復合物。
[0016] 上述技術方案中，所述步驟一，在〇°C~4°C下，并在攪拌的狀態(tài)下，將配方量的 PluronicF-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中，然后繼續(xù)攪拌12 小時~24小時，得到混合液，然后將混合液在2°C~4°C下靜置22小時~26小時后，得到半透 明液態(tài)物。
[0017] 上述技術方案中，所述步驟二，在2°C~4°C下，將Lingo-1shRNA慢病毒表達載體 與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有1X107TU/ml~4X107TU/ml 的Lingo-1shRNA慢病毒表達載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混合液； 所述步驟三，在2°C~4°C下，將配方量的神經(jīng)生長因子混合物加入到步驟二得到的第 二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液。
[0018] 上述技術方案中，所述步驟四，所述微孔過濾器的孔徑為0. 15ym~0. 35ym。
[0019] 為了實現(xiàn)上述目的之三，本發(fā)明采用如下技術方案： 上述所述的PF-127-L