V-NFcocktail復(fù)合物或者上述所述的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的應(yīng)用，將 PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物應(yīng)用于負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞，能促進(jìn)移植性神經(jīng)干細(xì)胞的 定向分化和存活，進(jìn)而將移植性神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于治療脊髓損傷疾病。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，有益效果在于： (1)本發(fā)明提供的一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物，能夠 負(fù)載移植神經(jīng)干細(xì)胞、并能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化和神經(jīng)再生。
[0020] (2)本發(fā)明提供的一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物， 用于移植神經(jīng)干細(xì)胞治療脊髓損傷，該P(yáng)F-127-LV-NFcocktail復(fù)合物能夠抑制LING0-1基 因與髓磷脂抑制因子的結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)生長，從而使得更多的LING0-1拮抗劑通過拮抗神 經(jīng)干細(xì)胞LING0-1的表達(dá)，增加神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并促使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。
[0021] (3)本發(fā)明提供的一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物， 由于含有Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體，從而能夠特異性抑制神經(jīng)干細(xì)胞LING0-1基因 和蛋白表達(dá)，在PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物負(fù)載神經(jīng)干細(xì)胞的移植中，能夠明顯增加神 經(jīng)干細(xì)胞的增殖，并明顯提高神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的比例。
[0022] (4)本發(fā)明提供的一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物， 由于含有由腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因 子1、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組成的神經(jīng) 生長因子混合物，從而使得該P(yáng)F-127-LV-NFcocktail復(fù)合物在負(fù)載神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)，能夠促 進(jìn)移植神經(jīng)干細(xì)胞存活和增殖，并能為神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化提供有利的微環(huán)境條 件。
[0023] (5)本發(fā)明提供的一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物 的制備方法，具有方法簡單，生產(chǎn)成本低，無需高溫，無需特殊復(fù)雜、昂貴設(shè)備，且能夠適用 于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。
[0024] (6)本發(fā)明提供的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物用于負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn) 而將負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于治療脊髓損傷疾病，由于采用PF-127-LV-NFcocktail 復(fù)合物負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞，因此，既能利用PluronicF-127水凝膠的三維多孔洞生物 支架作用，為神經(jīng)干細(xì)胞分化神經(jīng)元及其軸突生長提供三維空間和一定的力學(xué)支撐，同時(shí) 用于移植治療脊髓損傷時(shí)還能夠有效填補(bǔ)脊髓損傷裂隙；又能夠利用PluronicF-127水 凝膠的遞送而實(shí)現(xiàn)Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體精確遞送于脊髓損傷部位，通過阻斷 LING0-1和髓磷脂抑制因子的結(jié)合，對抗損傷脊髓抑制性病理環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞定向分 化和神經(jīng)再生；另外，PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的神經(jīng)生長因子混合物則能夠?yàn)樯窠?jīng) 干細(xì)胞的存活和發(fā)育分化提供有利條件，因此，該P(yáng)F-127-LV-NFcocktail復(fù)合物能夠有力 促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療中樞和外周神經(jīng)損傷的醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用實(shí)踐及前景，能夠?yàn)榧顾钃p 傷患者的治療和康復(fù)提供新的治療途徑。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明的一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物包 裹神經(jīng)干細(xì)胞后的光學(xué)顯微鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為了使本發(fā)明所解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋 本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027] 其中，本發(fā)明的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物中，Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載 體是根據(jù)Genebank中公布的大鼠Lingo-1CDS序列進(jìn)行設(shè)計(jì)、合成的siRNA序列。
[0028] 實(shí)施例1。
[0029] 一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物，它包括以下組份： PluronicF-127水凝膠、完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基、Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體和神經(jīng)生 長因子混合物； 其中，神經(jīng)生長因子混合物由以下組份組成：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、 血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和膠 質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
[0030] 本實(shí)施例中，PluronicF-127水凝膠與完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的混合比例為每 100mL完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20g的PluronicF-127水凝膠； 本實(shí)施例中，PluronicF-127水凝膠與神經(jīng)生長因子混合物的質(zhì)量比為20:15 ; 本實(shí)施例中，Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體在PluronicF-127水凝膠和完全神經(jīng)干 細(xì)胞培養(yǎng)基混合后得到的混合液中的滴度為2X107TU/ml。
[0031] 本實(shí)施例中，神經(jīng)生長因子混合物中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子_3、血 小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和膠質(zhì) 細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合質(zhì)量比為5:5:1:1:1:1:1。
[0032] 其中，完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基是通過往DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入胎牛血清、堿性 成纖維細(xì)胞生長因子、青霉素和鏈霉素配制而成。本實(shí)施例的完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，胎 牛血清的質(zhì)量百分比濃度為2%，堿性成纖維細(xì)胞生長因子的質(zhì)量體積濃度為10ng/mL，青 霉素的質(zhì)量體積濃度為100ug/mL，鏈霉素的質(zhì)量體積濃度為100yg/mL。
[0033] 其中，Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體的基本特征如下： ReporterGene:GFP CloningSiteat5' ：BamHICloningSiteat3' ：EcoRI HairpinLoopSequence:TCAAGAG TargetSize: 19mers〇
[0034] 上述一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法， 它包括以下步驟： 步驟一，PluronicF-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基：在0°C下，并在攪拌的 狀態(tài)下，將配方量的PluronicF-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基 中，然后繼續(xù)攪拌20小時(shí)，得到混合液，然后將混合液在2°C下靜置24小時(shí)后，得到半透明 液態(tài)物； 步驟二，加入Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體：在2°C下，將Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá) 載體與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有2X107TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表達(dá)載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混合液； 步驟三，加入神經(jīng)生長因子混合物：在2°C下，將配方量的神經(jīng)生長因子混合物加入到 步驟二得到的第二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液； 步驟四，過濾除菌：將步驟三得到的第三混合液用孔徑為0. 22ym的微孔過濾器進(jìn)行 過濾除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物。
[0035]上述PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail 復(fù)合物應(yīng)用于負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞，能促進(jìn)移植性神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化和存活，進(jìn)而 將移植性神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于治療脊髓損傷疾病。
[0036] 實(shí)施例2。
[0037] 一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物，它包括以下組份： PluronicF-127水凝膠、完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基、Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體和神經(jīng)生 長因子混合物； 其中，神經(jīng)生長因子混合物由以下組份組成：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、 血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和膠 質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
[0038] 本實(shí)施例中，PluronicF-127水凝膠與完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的混合比例為每 100mL完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入15g的PluronicF-127水凝膠； 本實(shí)施例中，PluronicF-127水凝膠與神經(jīng)生長因子混合物的質(zhì)量比為15:10 ; 本實(shí)施例中，Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體在PluronicF-127水凝膠和完全神經(jīng)干 細(xì)胞培養(yǎng)基混合后得到的混合液中的滴度為IX107TU/ml。
[0039] 本實(shí)施例中，神經(jīng)生長因子混合物中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子_3、血 小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和膠質(zhì) 細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合質(zhì)量比為3:3:0. 5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5。
[0040] 其中，完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基是通過往DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入胎牛血清、堿性 成纖維細(xì)胞生長因子、青霉素和鏈霉素配制而成。本實(shí)施例的完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，胎 牛血清的質(zhì)量百分比濃度為2%，堿性成纖維細(xì)胞生長因子的質(zhì)量體積濃度為10ng/mL，青 霉素的質(zhì)量體積濃度為100ug/mL，鏈霉素的質(zhì)量體積濃度為100yg/mL。
[0041] 其中，Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體的基本特征如下： ReporterGene:GFP CloningSiteat5' ：BamHICloningSiteat3' ：EcoRI HairpinLoopSequence:TCAAGAG TargetSize: 19mers〇
[0042] 上述一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的