制備方法， 它包括以下步驟： 步驟一，PluronicF-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基：在4°C下，并在攪拌的 狀態(tài)下，將配方量的PluronicF-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基 中，然后繼續(xù)攪拌24小時，得到混合液，然后將混合液在4°C下靜置22小時后，得到半透明 液態(tài)物； 步驟二，加入Lingo-1shRNA慢病毒表達載體：在4°C下，將Lingo-1shRNA慢病毒表達 載體與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有IX107TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混合液； 步驟三，加入神經(jīng)生長因子混合物：在4°C下，將配方量的神經(jīng)生長因子混合物加入到 步驟二得到的第二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液； 步驟四，過濾除菌：將步驟三得到的第三混合液用孔徑為0. 15ym的微孔過濾器進行 過濾除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail復合物。
[0043]上述PF-127-LV-NFcocktail復合物的制備方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail 復合物應用于負載移植性神經(jīng)干細胞，能促進移植性神經(jīng)干細胞的定向分化和存活，進而 將移植性神經(jīng)干細胞應用于治療脊髓損傷疾病。
[0044] 實施例3。
[0045] 一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復合物，它包括以下組份： PluronicF-127水凝膠、完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基、Lingo-1shRNA慢病毒表達載體和神經(jīng)生 長因子混合物； 其中，神經(jīng)生長因子混合物由以下組份組成：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、 血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和膠 質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
[0046] 本實施例中，PluronicF-127水凝膠與完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基的混合比例為每 100mL完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中加入25g的PluronicF-127水凝膠； 本實施例中，PluronicF-127水凝膠與神經(jīng)生長因子混合物的質(zhì)量比為25:20 ;本實施例中，Lingo-1shRNA慢病毒表達載體在PluronicF-127水凝膠和完全神經(jīng)干 細胞培養(yǎng)基混合后得到的混合液中的滴度為4X107TU/ml。
[0047] 本實施例中，神經(jīng)生長因子混合物中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子_3、血 小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和膠質(zhì) 細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合質(zhì)量比為7:7:1.5: 1.5: 1.5: 1.5: 1.5。
[0048] 其中，完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基是通過往DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入胎牛血清、堿性 成纖維細胞生長因子、青霉素和鏈霉素配制而成。本實施例的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中，胎 牛血清的質(zhì)量百分比濃度為2%，堿性成纖維細胞生長因子的質(zhì)量體積濃度為10ng/mL，青 霉素的質(zhì)量體積濃度為100ug/mL，鏈霉素的質(zhì)量體積濃度為100yg/mL。
[0049] 其中，Lingo-1shRNA慢病毒表達載體的基本特征如下： ReporterGene:GFP CloningSiteat5' ：BamHICloningSiteat3' ：EcoRI HairpinLoopSequence:TCAAGAG TargetSize: 19mers〇
[0050] 上述一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復合物的制備方法， 它包括以下步驟： 步驟一，PluronicF-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基：在2°C下，并在攪拌的 狀態(tài)下，將配方量的PluronicF-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基 中，然后繼續(xù)攪拌12小時，得到混合液，然后將混合液在:TC下靜置26小時后，得到半透明 液態(tài)物； 步驟二，加入Lingo-1shRNA慢病毒表達載體：在3°C下，將Lingo-1shRNA慢病毒表達 載體與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有4X107TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混合液； 步驟三，加入神經(jīng)生長因子混合物：在3°C下，將配方量的神經(jīng)生長因子混合物加入到 步驟二得到的第二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液； 步驟四，過濾除菌：將步驟三得到的第三混合液用孔徑為0. 35ym的微孔過濾器進行 過濾除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail復合物。
[0051]上述PF-127-LV-NFcocktail復合物的制備方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail 復合物應用于負載移植性神經(jīng)干細胞，能促進移植性神經(jīng)干細胞的定向分化和存活，進而 將移植性神經(jīng)干細胞應用于治療脊髓損傷疾病。
[0052] 實施例4。
[0053] -種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復合物，它包括以下組份： PluronicF-127水凝膠、完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基、Lingo-1shRNA慢病毒表達載體和神經(jīng)生 長因子混合物； 其中，神經(jīng)生長因子混合物由以下組份組成：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、 血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和膠 質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
[0054] 本實施例中，PluronicF-127水凝膠與完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基的混合比例為每 100mL完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中加入18g的PluronicF-127水凝膠； 本實施例中，PluronicF-127水凝膠與神經(jīng)生長因子混合物的質(zhì)量比為17:12 ; 本實施例中，Lingo-1shRNA慢病毒表達載體在PluronicF-127水凝膠和完全神經(jīng)干 細胞培養(yǎng)基混合后得到的混合液中的滴度為3X107TU/ml。
[0055] 本實施例中，神經(jīng)生長因子混合物中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、血 小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和膠質(zhì) 細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合質(zhì)量比為4:5:0. 7: 1.2: 0.9: 0.8: 1.1。
[0056] 其中，完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基是通過往DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入胎牛血清、堿性 成纖維細胞生長因子、青霉素和鏈霉素配制而成。本實施例的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中，胎 牛血清的質(zhì)量百分比濃度為2%，堿性成纖維細胞生長因子的質(zhì)量體積濃度為10ng/mL，青 霉素的質(zhì)量體積濃度為100ug/mL，鏈霉素的質(zhì)量體積濃度為100yg/mL。
[0057] 其中，Lingo-1shRNA慢病毒表達載體的基本特征如下： ReporterGene:GFP CloningSiteat5' ：BamHICloningSiteat3' ：EcoRI HairpinLoopSequence:TCAAGAG TargetSize: 19mers〇
[0058] 上述一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復合物的制備方法， 它包括以下步驟： 步驟一，PluronicF-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基：在1°C下，并在攪拌的 狀態(tài)下，將配方量的PluronicF-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基 中，然后繼續(xù)攪拌15小時，得到混合液，然后將混合液在2. 5°C下靜置23小時后，得到半透 明液態(tài)物； 步驟二，加入Lingo-1shRNA慢病毒表達載體：在2. 5°C下，將Lingo-1shRNA慢病 毒表達載體與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有3X107TU/ml的 Lingo-1shRNA慢病毒表達載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混合液； 步驟三，加入神經(jīng)生長因子混合物：在2. 5°C下，將配方量的神經(jīng)生長因子混合物加入 到步驟二得到的第二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液； 步驟四，過濾除菌：將步驟三得到的第三混合液用孔徑為0. 25ym的微孔過濾器進行 過濾除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail復合物。
[0059]上述PF-127-LV-NFcocktail復合物的制備方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail 復合物用于促進移植性神經(jīng)干細胞定向分化和存活的應用，即，將PF-127-LV-NFcocktail 復合物用于負載移植神經(jīng)干細胞，然后用于治療脊髓損傷的應用。
[0060] 實施例5。
[0061] 一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復合物，它包括以下組份： PluronicF-127水凝膠、完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基、Lingo-1shRNA慢病毒表達載體和神經(jīng)生 長因子混合物； 其中，神經(jīng)生長因子混合物由以下組份組成：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、 血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和膠 質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
[0062] 本實施例中，PluronicF-127水凝膠與完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基的混合比例為每 100mL完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中加入22g的PluronicF-127水凝膠； 本實施例中，PluronicF-127水凝膠與神經(jīng)生長因子混合物的質(zhì)量比為23:18 ; 本實施例中，Lingo-1shRNA慢病毒表達載體在PluronicF-127水凝膠和完全神經(jīng)干 細胞培養(yǎng)基混合后得到的混合液中的滴度為2. 5X107TU/ml。
[0063] 本實施例中，神經(jīng)生長因子混合物中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子_3、血 小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和膠質(zhì) 細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合質(zhì)量比為6:4:1.3: 0.8: 1.4: 1.2: 0.9。
[0064] 其中，完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基是通過往DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入胎牛血清、