堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、青霉素和鏈霉素配制而成。本實(shí)施例的完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，胎 牛血清的質(zhì)量百分比濃度為2%，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的質(zhì)量體積濃度為10ng/mL，青 霉素的質(zhì)量體積濃度為100ug/mL，鏈霉素的質(zhì)量體積濃度為100yg/mL。
[0065] 其中，Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體的基本特征如下： ReporterGene:GFP CloningSiteat5' ：BamHICloningSiteat3' ：EcoRI HairpinLoopSequence:TCAAGAG TargetSize: 19mers〇
[0066] 上述一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法， 它包括以下步驟： 步驟一，PluronicF-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基：在3°C下，并在攪拌的 狀態(tài)下，將配方量的PluronicF-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基 中，然后繼續(xù)攪拌22小時(shí)，得到混合液，然后將混合液在3. 5°C下靜置25小時(shí)后，得到半透 明液態(tài)物； 步驟二，加入Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體：在3. 5°C下，將Lingo-1shRNA慢病毒 表達(dá)載體與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有2. 5X107TU/ml的Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混合液； 步驟三，加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子混合物：在3. 5°C下，將配方量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子混合物加入 到步驟二得到的第二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液； 步驟四，過(guò)濾除菌：將步驟三得到的第三混合液用孔徑為0. 30ym的微孔過(guò)濾器進(jìn)行 過(guò)濾除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物。
[0067]上述PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail 復(fù)合物應(yīng)用于負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞，能促進(jìn)移植性神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化和存活，進(jìn)而 將移植性神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于治療脊髓損傷疾病。
[0068] 實(shí)施例6。
[0069] 一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物，它包括以下組份： PluronicF-127水凝膠、完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基、Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體和神經(jīng)生 長(zhǎng)因子混合物； 其中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子混合物由以下組份組成：腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、 血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和膠 質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
[0070] 本實(shí)施例中，PluronicF-127水凝膠與完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的混合比例為每 100mL完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入19g的PluronicF-127水凝膠； 本實(shí)施例中，PluronicF-127水凝膠與神經(jīng)生長(zhǎng)因子混合物的質(zhì)量比為24:16 ; 本實(shí)施例中，Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體在PluronicF-127水凝膠和完全神經(jīng)干 細(xì)胞培養(yǎng)基混合后得到的混合液中的滴度為3. 5X107TU/ml。
[0071] 本實(shí)施例中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子混合物中，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子_3、血 小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和膠質(zhì) 細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合質(zhì)量比為5:6:0. 9: 0.6: 0.6: 1.4: 1.3。
[0072] 其中，完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基是通過(guò)往DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入胎牛血清、堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、青霉素和鏈霉素配制而成。本實(shí)施例的完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，胎 牛血清的質(zhì)量百分比濃度為2%，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的質(zhì)量體積濃度為10ng/mL，青 霉素的質(zhì)量體積濃度為100ug/mL，鏈霉素的質(zhì)量體積濃度為100yg/mL。
[0073] 其中，Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體的基本特征如下： ReporterGene:GFP CloningSiteat5' ：BamHICloningSiteat3' ：EcoRI HairpinLoopSequence:TCAAGAG TargetSize: 19mers〇
[0074] 上述一種負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法， 它包括以下步驟： 步驟一，PluronicF-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基：在1. 5°C下，并在攪拌 的狀態(tài)下，將配方量的PluronicF-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基 中，然后繼續(xù)攪拌18小時(shí)，得到混合液，然后將混合液在3°C下靜置24. 5小時(shí)后，得到半透 明液態(tài)物； 步驟二，加入Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體：在3°C下，將Lingo-1shRNA慢病毒 表達(dá)載體與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有3. 5X107TU/ml的 Lingo-1shRNA慢病毒表達(dá)載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混合液； 步驟三，加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子混合物：在3°C下，將配方量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子混合物加入到 步驟二得到的第二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液； 步驟四，過(guò)濾除菌：將步驟三得到的第三混合液用孔徑為0. 18ym的微孔過(guò)濾器進(jìn)行 過(guò)濾除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物。
[0075]上述PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail 復(fù)合物應(yīng)用于負(fù)載移植性神經(jīng)干細(xì)胞，能促進(jìn)移植性神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化和存活，進(jìn)而 將移植性神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于治療脊髓損傷疾病。
[0076] 應(yīng)用實(shí)驗(yàn) 一、PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物包裹神經(jīng)干細(xì)胞三維培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn) 1.種子細(xì)胞的分離、培養(yǎng)鑒定 大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞取材及培養(yǎng)：取孕齡為14天的SD大鼠處死，然后利用濃度為 75%的乙醇浸泡處死后的SD大鼠以進(jìn)行消毒，然后在無(wú)菌條件下打開(kāi)SD大鼠的腹腔，取出 胎鼠，然后取出胎鼠的大腦皮質(zhì)并移至培養(yǎng)皿，然后將胎鼠的大腦皮質(zhì)剪碎并輕輕吹打其 呈懸濁狀，過(guò)200目篩網(wǎng)，離心棄去上清液，將沉淀用不完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM/F-12 必需培養(yǎng)基，內(nèi)加l〇ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，100y/ml青霉素和100yg/ml 鏈霉素)重懸，然后種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件參照[AbematsuMetal，JClinInvest， 2010]〇 培養(yǎng)方法：在顯微鏡下觀察細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞懸浮成"神經(jīng)球"生長(zhǎng)，通常情況下，每?jī)?天換液一次，每四天傳代一次。然后置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代至3~5代的細(xì) 胞用于移植。
[0077] 培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞鑒定：用神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nestin熒光免疫染色檢測(cè)鑒定生 長(zhǎng)的神經(jīng)球。結(jié)果顯示培養(yǎng)細(xì)胞確為神經(jīng)干細(xì)胞。
[0078]制備移植神經(jīng)干細(xì)胞懸浮液：在生物安全柜或者超凈臺(tái)中，將培養(yǎng)瓶中的含有神 經(jīng)球的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，然后進(jìn)行500rpm離心5分鐘，收集神經(jīng)干細(xì)胞。加 入lml濃度為0. 125%含有EDTA的胰酶，在超凈工作臺(tái)中輕輕吹打10次，注意不要消化太 久，消化的目的是縮小神經(jīng)球的體積，分散成單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，而不是消化神經(jīng)干細(xì)胞。然 后加入5ml培養(yǎng)基，吹打均勻后進(jìn)行l(wèi)OOOrpm離心5分鐘，去掉上清液，得到神經(jīng)干細(xì)胞。
[0079] 2.PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物包裹神經(jīng)干細(xì)胞 在0°C~4°C下，用PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物重懸上述得到的神經(jīng)干細(xì)胞，得到神 經(jīng)干細(xì)胞懸浮液，準(zhǔn)備移植。待移植的神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞懸浮液在PF-127-LV-NFcocktail復(fù) 合物中的配制濃度約為2X103個(gè)/yL，然后在無(wú)菌條件下輕輕攪拌神經(jīng)干細(xì)胞懸浮液使 PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物與神經(jīng)干細(xì)胞包裹均勻，然后將神經(jīng)干細(xì)胞懸浮液接種到 培養(yǎng)板中，并將培養(yǎng)板保持在37°C、5% 0)2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中5分鐘，以誘導(dǎo)凝膠形成，并利 用光學(xué)顯微鏡確認(rèn)神經(jīng)干細(xì)胞被PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物均勻包裹，見(jiàn)圖1。即完成 PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的包裹負(fù)載。然后用常規(guī)完全神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 基覆蓋培養(yǎng)板孔(不超過(guò)板孔體積1/2)，并在含37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0080] 3.PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物包裹三維培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的效果觀察檢測(cè) 表1活/死（Live/Dead)染色檢測(cè)不同方式培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞4天后的存活細(xì)胞百分 比（x土s)
培養(yǎng)組與對(duì)照組（PluronicF-127水凝膠平面二維培養(yǎng)）比較p〈0. 01 由表1可知，培養(yǎng)組的神經(jīng)干細(xì)胞存活率明顯高于對(duì)照組，從而說(shuō)明 PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物負(fù)載三維培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞能夠顯著提高神經(jīng)干細(xì)胞的存活 率。
[0081] 表2免疫熒光染色檢測(cè)不同方式培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞7天后的Nestin(神經(jīng)干細(xì)胞 標(biāo)志蛋白）染色陽(yáng)性細(xì)胞比例（x土s)
培養(yǎng)組與對(duì)照組(培養(yǎng)皿正常培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)）比較P〈〇. 01。
[0082] 由表2可知，培養(yǎng)組的Nestin染色陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，從而說(shuō)明了 PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物負(fù)載三維培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞能夠明顯提高神經(jīng)干細(xì)胞的增殖 率。
[0083] 表3免疫熒光檢測(cè)不同方式培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞14天后其分化為不同譜系細(xì)胞的比 例（x土s)
培養(yǎng)組與對(duì)照組(培養(yǎng)皿貼壁誘導(dǎo)分化培養(yǎng)）比較P〈〇. 01。
[0084] 分別進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)志蛋白分子0IIItublin、星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白神經(jīng)膠質(zhì)纖 維酸性蛋白（GFAP)、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白2'，3' -環(huán)核苷酸3' -磷酸二酯酶（CNPase) 的免疫熒光染色檢測(cè)，由表3可以看出，PF-127-LV-NF