cocktail復(fù)合物負載培養(yǎng)神經(jīng)干細 胞組分化為神經(jīng)元的比例（即0IIItublin染色陽性細胞比例）明顯優(yōu)于對照組。培養(yǎng)組少 突膠質(zhì)細胞分化比例（即CNPase染色陽性細胞比例)較對照組略有增加，而培養(yǎng)組中分化成 星型膠質(zhì)細胞的比例（即GFAP染色陽性細胞比例）較對照組下降。
[0085] 二、PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物包裹神經(jīng)干細胞移植治療脊髓損傷 1.脊髓全橫斷大鼠模型制作： 雌性SD大鼠，體重180g~220g，施行T10脊髓全橫斷手術(shù)，然后用10%水合氯醛（3. 5mg/kg)麻醉，切除錐板，暴露T10胸段脊髓，用尖細的手術(shù)刀橫向切除脊髓組織，造成脊髓縱向 約2mm寬的損傷裂隙。手術(shù)盡量遵循無菌操作。依次縫合肌肉和皮膚。術(shù)后護理：一日三 次人工協(xié)助膀胱排尿，直至大鼠膀胱反射功能恢復(fù)自主排尿。其他常規(guī)喂飼。
[0086] 2.PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物包裹神經(jīng)干細胞移植 移植總量均為10yL。移植的神經(jīng)干細胞細胞懸浮液在PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合 物中的配制濃度約為2X103個/yL。大鼠手術(shù)一周后，在脊髓損傷裂隙中用微量注射器 植入。注意微量注射器尖端謹慎插入脊髓橫斷損傷裂隙中心位置，盡量勿觸及周圍脊髓，植 入后依次縫合肌肉和皮膚。術(shù)后護理：一日三次人工協(xié)助膀胱排尿，直至大鼠膀胱反射功能 恢復(fù)自主排尿。其他常規(guī)喂飼。所有大鼠每日一次皮下注射環(huán)孢素A免疫抑制劑（10mg/kg)與慶大霉素（8mg/kg)。
[0087] 3.PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物包裹神經(jīng)干細胞移植 表4Tunnel染色檢測PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物負載神經(jīng)干細胞移植7天后大 鼠脊髓損傷局部及其鄰近部位細胞比例（x土
s) 移植組與對照組(脊髓損傷后單純移植神經(jīng)干細胞）比較p〈〇. 01。
[0088] 由表4可知，PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物負載神經(jīng)干細胞移植治療脊髓損傷與 單純移植神經(jīng)干細胞對照組相比，能夠明顯減少移植脊髓損傷的神經(jīng)干細胞及鄰近脊髓組 織細胞凋亡。
[0089] 表5尼氏染色檢測PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物負載神經(jīng)干細胞移植28天后大 鼠脊髓損傷部位及其鄰近神經(jīng)元數(shù)量(個）（x土s)
移植組與對照組(脊髓損傷后單純移植神經(jīng)干細胞）比較p〈〇. 01。
[0090] 在不同處理取材脊髓損傷縱切面經(jīng)尼氏染色檢測，由表5可看出， PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物負載神經(jīng)干細胞的移植組大鼠標(biāo)本其脊髓損傷部位及其鄰 近神經(jīng)元數(shù)量明顯多于對照組，從而說明了PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物負載神經(jīng)干細 胞移植一方面能夠促進移植神經(jīng)干細胞對脊髓損傷大鼠分化為脊髓神經(jīng)元，且有顯著作 用。
[0091] 最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保 護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實 質(zhì)和范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物，其特征在于：它包括 以下組份：Pluronic F-127水凝膠、完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基、Lingo-1 shRNA慢病毒表達載 體和神經(jīng)生長因子混合物； 所述神經(jīng)生長因子混合物由以下組份組成：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、 血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和膠 質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合 物，其特征在于：所述Pluronic F-127水凝膠與所述完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基的混合比例為 每IOOmL完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中加入15g~25g的Pluronic F-127水凝膠； 所述Pluronic F-127水凝膠與所述神經(jīng)生長因子混合物的質(zhì)量比為15~25:10~20 ; 所述Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體在所述Pluronic F-127水凝膠和所述完全神經(jīng) 干細胞培養(yǎng)基混合后得到的混合液中的滴度為IXlO7 TU/ml~4XlO7 TU/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合 物，其特征在于：所述神經(jīng)生長因子混合物中，所述腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、所述神經(jīng)營養(yǎng)因 子-3、所述血小板源性生長因子、所述胰島素樣生長因子1、所述表皮生長因子、所述堿性 成纖維細胞生長因子和所述膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的混合質(zhì)量比為3~7:3~7:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5:0. 5~1. 5。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合 物，其特征在于：所述完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基是通過往DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入胎牛血清、 堿性成纖維細胞生長因子、青霉素和鏈霉素配制而成。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合 物，其特征在于：所述Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體的基本特征如下： Reporter Gene: GFP Cloning Site at 5' ： BamHI Cloning Site at 3' ： EcoRI Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG Target Size: 19mers〇6. 權(quán)利要求1至5任意一項所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的 PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法，其特征在于：它包括以下步驟： 步驟一，Pluronic F-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基：在一定溫度下，并在攪 拌的狀態(tài)下，將配方量的Pluronic F-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng) 基中，然后繼續(xù)攪拌一定時間，得到混合液，然后將混合液在一定溫度下靜置一定時間后， 得到半透明液態(tài)物； 步驟二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體：在一定溫度下，將Lingo-1 shRNA慢 病毒表達載體與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有IXlO7 TU/ ml~4X IO7 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混 合液； 步驟三，加入神經(jīng)生長因子混合物：在一定溫度下，將配方量的神經(jīng)生長因子混合物加 入到步驟二得到的第二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液； 步驟四，過濾除菌：將步驟三得到的第三混合液用一定孔徑的微孔過濾器進行過濾除 困后，即得到PF_127_LV_NFcocktail復(fù)合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù) 合物的制備方法，其特征在于：所述步驟一，在〇°C ~4°C下，并在攪拌的狀態(tài)下，將配方量的 Pluronic F-127水凝膠緩慢加入到配方量的完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中，然后繼續(xù)攪拌12 小時~24小時，得到混合液，然后將混合液在2°C ~4°C下靜置22小時~26小時后，得到半透 明液態(tài)物。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合 物的制備方法，其特征在于：所述步驟二，在2°C ~4°C下，將Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體 與步驟一得到的半透明液態(tài)物以每毫升半透明液態(tài)物中含有IXlO7 TU/ml~4X IO7 TU/ml 的Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體的濃度混合，并攪拌均勻，得到第二混合液； 所述步驟三，在2°C ~4°C下，將配方量的神經(jīng)生長因子混合物加入到步驟二得到的第 二混合液中，并攪拌均勻，得到第三混合液。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合 物的制備方法，其特征在于：所述步驟四，所述微孔過濾器的孔徑為〇. 15 ym ~0. 35 ym。10. 權(quán)利要求1至5任意一項所述的一種負載移植性神經(jīng)干細胞的 PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物或者權(quán)利要求6至9任意一項所述的一種負載移植性神經(jīng)干 細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物 的應(yīng)用，其特征在于：將PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物應(yīng)用于負載移植性神經(jīng)干細胞，能 促進移植性神經(jīng)干細胞的定向分化和存活，進而將移植性神經(jīng)干細胞應(yīng)用于治療脊髓損傷 疾病。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種負載移植性神經(jīng)干細胞的PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。該復(fù)合物包括：Pluronic F-127水凝膠、完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基、Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體和神經(jīng)生長因子混合物。該PF-127-LV-NFcocktail復(fù)合物的制備方法，包括：步驟一，Pluronic F-127水凝膠溶解于完全神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基；步驟二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表達載體；步驟三，加入神經(jīng)生長因子混合物；步驟四，過濾除菌。該復(fù)合物能夠負載移植神經(jīng)干細胞、并能促進神經(jīng)干細胞定向分化和神經(jīng)再生。
【IPC分類】A61L27/26, A61L27/22, A61L27/18, A61L27/52, A61L27/36, A61L27/54
【公開號】CN104958786
【申請?zhí)枴緾N201510444938
【發(fā)明人】吳洪福, 吳武田, 邱文鋒, 熊興東, 周光紀(jì), 崔新月, 陳立毅, 張文輝, 羅傳銘, 廖小龍
【申請人】廣東醫(yī)學(xué)院
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月27日