一種雙特異性抗體egfr×cd3的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，設(shè)及雙特異性抗體的構(gòu)建和制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙特異性抗體化ispecificantibody,BiAb)是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點的 人工抗體，能在祀細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導(dǎo)向性的效應(yīng)功能。BiAb在 生物醫(yī)學(xué)中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過BiAb介導(dǎo)細胞毒作用 殺死腫瘤細胞是當(dāng)前免疫治療應(yīng)用研究的熱點，其主要特點是BiAb能同時結(jié)合腫瘤相關(guān) 抗原和免疫效應(yīng)細胞上的祀分子，直接觸發(fā)免疫效應(yīng)細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。W下 是針對所研究的免疫細胞抗原和腫瘤細胞抗原，W及相關(guān)技術(shù)發(fā)展的一些【背景技術(shù)】介紹。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4個亞基組成；5、e、丫、C，其分子質(zhì)量分別為18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其長度分別有171、207、182、164個氨基酸殘基。它們一起組成6條膚鏈， 常與T細胞受體（Tcellrec巧tor，TCR)緊密結(jié)合形成含有8條膚鏈的TCR-CD3復(fù)合體，結(jié) 構(gòu)示意圖見圖1。此復(fù)合體具有T細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)的功能。CD3胞質(zhì)段含免 疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，TCR 識別并結(jié)合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原膚，導(dǎo)致CD3的 ITAM的保守序列的酪氨酸殘基被T細胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磯酸化，然后可募集其 他含有甜2(Scrhomology2)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磯酸化和與 ZAP-70的結(jié)合是T細胞活化信號傳導(dǎo)過程早期階段的重要生化反應(yīng)之一。因此，CD3分子 的功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR識別抗原所產(chǎn)生的活化信號。
[000引 2.EGFR
[0006] 表皮生長因子受體巧GFR，EpidermalGrowthFactorReceptor)是表皮生長 因子巧G巧細胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體。EGFR屬于化bB受體家族的一種，該家族包括 EGFR巧rbB-1)，肥R2/c-neu巧rbB-2)，Her3 巧rbB-3)和Her4 巧rbB-4)。EGFR也被稱作 肥R1、化bBl，突變或過表達一般會引發(fā)腫瘤。EGFR是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受 體，細胞膜貫通，分子量17〇KDa。EGFR位于細胞膜表面，靠與配體結(jié)合來激活，包括EGF和 TGFa(transforminggrowthfactora)。激活后，EGFR由單體轉(zhuǎn)化為二聚體，盡管也有 證據(jù)表明，激活前也存在二聚體。EGFR還可能和化bB受體家族的其他成員聚合來激活，例 如&rbB2/Her2/neu。
[0007] 在配體與EGFR結(jié)合后，受體發(fā)生了二聚作用，二聚作用既包括兩個同種受體分子 的結(jié)合（同源性二聚作用），也包括人類EGF相關(guān)性受體（HER)酪氨酸激酶家族中的不同成 員的結(jié)合（異源性二聚作用）。二聚作用后是酪氨酸殘基的自磯酸化作用。該些磯酸化的 殘基是募集適配蛋白和額外的酪氨酸激酶底物的結(jié)合位點。蛋白質(zhì)在激活的受體復(fù)合物中 相互作用刺激ras蛋白，導(dǎo)致磯酸化級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生和絲裂原激活蛋白（MA巧激酶的激活。 或者轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)和激活、磯脂酷肌醇激酶-3(PI3K)-Akt和應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK)信 號傳導(dǎo)通路將被激活。該些信號通路依次觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄，同時控制細胞增生、分化和生存的 通路被激活。
[000引EGFR介導(dǎo)信號通路的特異性和強度取決于激活蛋白的性質(zhì)和四種EGFR家族成員 的水平。與肥R2結(jié)合的配體不詳，但當(dāng)肥R2和EGFR共表達時，前者經(jīng)常與配體激活的后 者結(jié)合形成二聚體。該種異源性二聚體與EGFR同源性二聚體相比，往往具有更高的再利用 率、穩(wěn)定性和傳導(dǎo)信號的能力。EGFR也能與肥R3和肥R4發(fā)生二聚作用，其產(chǎn)物具有更高的 持久性和更強的PI3K活性。EGFR信號傳導(dǎo)通路一旦配體結(jié)合的EGFR被內(nèi)吞入細胞，信號 將終止，受體將被降解或再循環(huán)到細胞膜表面，該取決于配體的性質(zhì)。例如，EGF結(jié)合的受 體將被降解，而TGF-a結(jié)合的受體則進入再循環(huán)。不同的生長因子會影響EGFR信號通路 的數(shù)量和持續(xù)時間。
[0009]EGFR信號通路有多重的生物學(xué)作用。例如，ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激細胞的分 裂和遷徙。EGFR也是多種受體通路的重要介體，起到信號會聚點的作用，能夠?qū)⑿盘栒?與多樣化。例如，在應(yīng)激、膜解聚作用和一些非生理性刺激物（包括氧化劑、放射線和燒化 劑）的反應(yīng)中，反向激活能誘導(dǎo)EGFR酪氨酸激酶的磯酸化并隨后發(fā)生信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。EGFR家 族的成員在正常發(fā)育中起了重要的作用，但在人類腫瘤中經(jīng)常過度表達并失去控制。
[0010]研究表明在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達。EGFR與腫瘤細胞的 增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細胞調(diào)亡的抑制有關(guān)。其可能機制有；EGFR的高表達引 起下游信號傳導(dǎo)的增強；突變型EGFR受體或配體表達的增加導(dǎo)致EGFR的持續(xù)活化；自分 泌環(huán)的作用增強；受體下調(diào)機制的破壞；異常信號傳導(dǎo)通路的激活等。EGFR的過表達在惡 性腫瘤的演進中起重要作用，膠質(zhì)細胞、腎癌、肺癌、前列腺癌、膜腺癌、乳腺癌等組織中都 有EGFR的過表達。對膠質(zhì)細胞瘤的研究發(fā)現(xiàn)EGFR的高表達主要與其基因擴增有關(guān)。但有 時EGFR表達水平的調(diào)節(jié)異常也存在于翻譯及翻譯后。EGFR在腫瘤中的高表達還可能與活 化后降解減少有關(guān)，一些研究指出c-Src可通過抑制受體泛素化和內(nèi)吞作用而上調(diào)EGFR水 平。許多腫瘤中有突變型EGFR存在，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多種EGFR突變型。突變型EGFR的作用可 能包括；具有配體非依賴型受體的細胞持續(xù)活化；由于EGFR的某些結(jié)構(gòu)域缺失而導(dǎo)致受體 下調(diào)機制的破壞、異常信號傳導(dǎo)通路的激活、細胞調(diào)亡的抑制等。突變體的產(chǎn)生是由于EGFR 基因的缺失、突變和重排。EGFR的配體對細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)有很大影響。EGFR的配體通過自 分泌形式激活EGFR促進細胞增殖，他們的共表達往往預(yù)示腫瘤預(yù)后不良，例如，在乳腺浸 潤性導(dǎo)管癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TGFa與EGFR共表達，且該種共表達與病人的生存率顯著相關(guān)。 Kopp等人對結(jié)/直腸癌的研究表明腫瘤的自分泌生長是EGFR的過表達及其配體表達共同 作用的結(jié)果。
[0011]此外，對EGFR與腫瘤的血管生成、高侵襲性及轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)EGFR可W通過Ang-1及VEGF等因子水平的調(diào)節(jié)而影響腫瘤血管生成。
[0012] 3.雙特異性抗體技術(shù)發(fā)展
[0013] 雙特異性抗體，一個抗體分子中的兩個抗原結(jié)合部位可分別結(jié)合兩種不同的抗原 表位的抗體。
[0014] 抗體藥物是W細胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的生物 大分子藥物，具有特異性高、性質(zhì)均一、可針對特定祀點定向制備等優(yōu)點。單克隆抗體在臨 床上主要應(yīng)用于W下=個方面：腫瘤治療、免疫性疾病治療W及抗感染治療。其中腫瘤的治 療是目前單抗應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域，目前已經(jīng)進入臨床試驗和上市的單抗產(chǎn)品中，用于腫 瘤治療的產(chǎn)品數(shù)量占比大概為50%。單克隆抗體治療腫瘤是一種針對病變細胞特異祀點刺 激免疫系統(tǒng)來殺傷祀細胞的免疫療法，為了增強抗體的效應(yīng)功能，特別是殺傷腫瘤細胞的 效果，人們嘗試多種方法改造抗體分子，雙特異性抗體是改善抗體治療效果的發(fā)展方向之 一，現(xiàn)已成為抗體工程研究領(lǐng)域的熱點。
[0015] 用于免疫治療的雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，能在 祀細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療 中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0016] 4.雙特異性抗體制備
[0017] 雙特異性抗體可通過多種途徑獲得，其制備方法主要有：化學(xué)偶聯(lián)法、雜交一雜交 瘤法和基因工程抗體制備法?；瘜W(xué)偶聯(lián)法是將2個不同的單克隆抗體用化學(xué)偶聯(lián)的方式連 接在一起，制備出了雙特異性單克隆抗體，該是最早的雙特異性單克隆抗體概念。雜交一雜 交瘤法是通過細胞雜交法或者=元雜交瘤的方式產(chǎn)生雙特異性單克隆抗體，該些細胞雜交 瘤或者=元雜交瘤是通過建成的雜交瘤融合，或者建立的雜交瘤和從小鼠得到的淋己細胞 融合而得到的，只能生產(chǎn)出鼠源的雙特異性抗體，它的應(yīng)用受到了極大的限制。而隨著分子 生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了基因工程人源化雙特異性抗體的多種構(gòu)建模式，并主要分 為雙特異性微抗體，雙鏈抗體，單鏈雙價抗體，多價雙特異性抗體四類。目前，國際上已有 數(shù)種基因工程雙特異性抗體藥物進入臨床試驗階段，并顯示有較好的應(yīng)用前景。
[001引 5.腫瘤的過繼免疫治療
[0019] 腫瘤的過繼免疫治療是將自體或異體的免疫活性細胞經(jīng)過體外擴增后輸入患者 體內(nèi)，直接殺傷腫瘤細胞，調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能，主要包括LAK細胞、TIL細胞、激活 的T淋己細胞和CIK細胞的免疫治療。而免疫療法只能清除少量的、零散的腫瘤細胞，對于 晚期的實體腫瘤療效有限。故常將其作為一種輔助療法與手術(shù)、化療、放療等常規(guī)方法聯(lián)合 應(yīng)用。先用常規(guī)方法清掃大量的腫瘤細胞后，再用免疫療法清除殘存的腫瘤細胞，可提高腫 瘤綜合治療的效果。其中，過繼免疫治療作為腫瘤綜合治療中的一個新方法，已經(jīng)與常規(guī)手 術(shù)治療、放療、化療及其他細胞和分子治療得到廣泛配合，在多種腫瘤的治療中展示了廣泛 的應(yīng)用前景。然而，一種更理想的方式應(yīng)該是，雙特異性抗體一端可W結(jié)合培養(yǎng)好的免疫細 胞的表面抗原CD3,并隨之一起輸入體內(nèi)，而雙特異性抗體的另一端能很好地結(jié)合腫瘤細 胞的表面抗原；該樣，雙特異性抗體就能在體內(nèi)架起腫瘤細胞和免疫細胞之間的橋梁，使免 疫細胞集中在腫瘤細胞周圍，進而對腫瘤細胞進行殺傷。通過該種方法可有效解決腫瘤細 胞的轉(zhuǎn)移和擴散，克服了手術(shù)、放化療S大傳統(tǒng)治療方式后的"不徹底、易轉(zhuǎn)移、副作用大" 等弊端。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 術(shù)語和縮略語
[0021] BiAb:雙特異性抗體化ispecificantibody)
[0022] TA:腫瘤抗原（tumorantigen)
[002引 VH:重鏈可變區(qū)化eavychainvari油leregion)。