實 驗方法的建立及其應(yīng)用。本發(fā)明包括雙特異性抗體藥物研究過程中所介導(dǎo)的免疫細(xì)胞殺 傷、雙特異性抗體的制備，W及雙特異性抗體體外藥效模型的建立和檢測。雙特異性抗體 MSB0DY包括一組單價單元（重輕鏈組合），另一組則為單鏈單元（ScFv連接化組合），其中 單價單元特異結(jié)合一種人的腫瘤細(xì)胞抗原，包括EGFR等一系列腫瘤細(xì)胞膜表面抗原，并且 在其重鏈化區(qū)進(jìn)行一些改造，使其相對野生型，不易自身形成二聚體；而另一組單鏈單元 特異結(jié)合另一種人的T細(xì)胞抗原CD3,同樣在其重鏈化區(qū)進(jìn)行另外一些改造，也不易自身形 成二聚體，而該兩組單元之間很容易形成異二聚體。與此同時，雙特異性抗體能在祀細(xì)胞和 功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療中具有廣 闊的應(yīng)用前景。
[0054]令人驚奇的是，本申請證明該種非對稱的抗體是穩(wěn)定的并具有高的抗原結(jié) 合效率。該是令人感到意外的，因為已經(jīng)證實在生理條件下即使是單鏈抗體的同二 聚體都是不穩(wěn)定的。例如，Ahmad等的"ScFvAntibody:PrinciplesandClinical Application,"ClinicalandDevelopmentalImmunology, 2012:980250(2012),顯示基于 ScFv的IgG類抗體不穩(wěn)定，并且需要進(jìn)一步改造W減少聚集并提高穩(wěn)定性。
[0055] 另外，因為具有非對稱性，異二聚體具有與由其中任一抗原結(jié)合多膚單元組成的 同二聚體所不同的等電點(diǎn)。基于異二聚體和同二聚體之間的等電點(diǎn)差異，可W容易地將需 要的異二聚體與同二聚體分離，大大減少了雙特異性抗體普遍存在的下游工藝開發(fā)存在的 困難。
【附圖說明】
[0056] 為了更清楚地說明本申請實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的 附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請中記載的一些實施例，對 于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來來說，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可W根據(jù)該些附圖獲得 其它的附圖，其中：
[0化7]圖1. CD3分子結(jié)構(gòu)示意圖。
[0化引圖2.EGFRXCD3雙特異性抗體分子示意圖。
[0化9]圖3.純化的雙抗體非變性SDS-PAGE電泳及純度檢測結(jié)果圖；M;蛋白分子量標(biāo) 記；1 ;M1001 ;2 ;M1003。
[0060] 圖4.EGFR和CD3雙抗原ELISA檢測抗體雙祀向能力結(jié)果圖。
[0061] 圖5.流式檢測熱挑戰(zhàn)實驗處理后雙抗體對肥T116細(xì)胞的結(jié)合情況圖。
[0062] 圖6.流式檢測熱挑戰(zhàn)實驗處理后雙抗體對人PBMC細(xì)胞的結(jié)合情況圖。
[0063] 圖7.EGFRXCD3MSB0DY與hPBMC對肥T116細(xì)胞的體外細(xì)胞毒實驗結(jié)果圖。
[0064] 圖8.EGFRXCD3MSB0DY與hPBMC對MDA-MB-453細(xì)胞的體外細(xì)胞毒實驗結(jié)果圖。 [00化]圖9.EGFRXCD3MSB0DY與hPBMC對肥K293細(xì)胞的體外細(xì)胞毒實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0066] 實施例1 ;雙特異性抗體的表達(dá)載體構(gòu)建巧GFRXCD3，M1001，M1003)
[0067] 1.雙特異性抗體序列設(shè)計
[0068]WEGFR和CD3為祀點(diǎn)的雙特異性抗體被命名為EGFRXCD3MSB0DY，其中單價單元 為抗EGFR的重鏈輕鏈對，可變區(qū)氨基酸序列參考單克隆抗體化bi化X的序列（PDB數(shù)據(jù)庫 序列號1YY8)和Vectibix的序列（來源為專利US6235883中的序列號38和49)，包括抗 EGFR重鏈與輕鏈，含有F油和化結(jié)構(gòu)域；單鏈單元為抗CD3的ScFv-化形式，可變區(qū)氨基 酸參考單克隆抗體L2K的序列（參考US20070123479序列號2)，包括抗CD3VH、VL、化結(jié)構(gòu) 域。其中單價單元的重鏈化和單鏈單元的化（同人IgGl的重鏈Fc)均進(jìn)行氨基酸突變改 造，具體化改造過程參見PCT/CN2012/084982,使其各自不易形成同二聚體化omodimer)， 而易于形成異二聚體化eterodimer)，該異二聚體即為雙特異性抗體EGFRXCD3MSB0DY，單 價單元來源于化bi化X的EGFRXCD3MSB0DY編號為M1001，單價單元來源于Vectibix的 EGFRXCD3MSB0DY編號為M1003。同時，為了EGFRXCD3MSB0DY能在C冊細(xì)胞中表達(dá)，并能 分泌到培養(yǎng)基中，選擇了鼠源抗體kappa鏈的前導(dǎo)膚序列作為分泌信號膚。各個結(jié)構(gòu)域及 信號膚的氨基酸序列和核酸序列見如下序列號：1-12。信號膚直接連接于抗體可變區(qū)的N 玉山 綱。
[0069] 單價單元重鏈氨基酸序列巧rbitux，序列號1)
[0070] QV化KQSGPGLVQPSQ化SITCTVSGF化TNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTS化SI N邸NSKSQVFFKMN化QSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LV邸YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY化SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KT肌CPPCPAP化LGGPSVFLFPPKP邸TLMISRTPEVTCVVVDVS肥DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP肥EQYNS TYRVVS化 DIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVM肥ALHN肌TQK化化SPGK
[0071] 單價單元重鏈棱酸序列巧rbitux，序列號2)
[0072] C過ggtgc過gctg過過過C過g過gcggcccgggcctggtgc過gccg過gcc過g過gcctg過gc過tt過cctgc過CC 咨t咨a咨C咨咨cttta咨cct咨accaactat咨咨C咨t咨catt咨咨咨t咨C咨cca咨a咨CCC咨咨咨caaa咨咨cct咨咨aat咨咨ct咨咨咨 cgtg過tttgg過gcggcggc過過C過ccg過tt過t過過C過ccccgttt過CC過gccgcctg過gc過tt過過C過過過g過t過過C過gc過 過過過gcc過ggtgtttttt過過過過tg過過C過gcctgc過g過gc過過eg過t過ccgcg過ttt過tt過ttgcgcgcgcgcgctg過CC t過tt過tg過tt過tg過過tttgcgt過ttggggcc過ggge過ccctggtg過ccgtg過gcgcggcgtcg過CC過過gggccc過tc ggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactact tccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacag tcctcaggactctactCCCtcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaa cgtg過過tc過c過過gccc過gc過過c過CC過過ggtgg過c過過g過過過gttg過gccc過過過tcttgtg過c過過過過etc過c過c過tgee caccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcat g過tctcccgg過cccctg過ggtc過c過tgcgtggtggtgg過cgtg過gcc過eg過過g過ccctg過ggtc過過gttc過過ctggt 過cgtgg過cggcgtgg過ggtgc過t過過tgee過過g過c過過過geegeggg過gg過gc過gt過c過過c過gc過cgt過ccgtgtggtc 過gcgtcctc過ccgtcctgc過CC過gg過ctggctg過過tgge過過gg過gt過c過過gtgc過過ggtctcc過過c過過過gccctccc agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtctacaccctgcccccatccc ggg過tg過gctg過CC過過g過過CC過ggtc過gcctgtggtgcctggtc過過過ggettet過tccc過geg過c過tcgccgtgg過g t咨咨咨a咨a咨caat咨咨咨ca咨CC咨咨a咨aacaactac咨ataccac咨cctccc咨t咨ct咨咨actcc咨ac咨咨ctccttcttcct ct過c過geg過tctc過ccgtgg過c過過g過gc過ggtggc過gc過gggg過過cgtcttctc過tgctccgtg過tgc過tg過ggctc tgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
[0073] 單價單元輕鏈氨基酸序列巧rbitux，序列號3)
[0074] DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSP化LIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFUSINSVE沈DIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW化LNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNS犯SVTE孤S邸STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT冊化SSPVTKSFNRGEC
[0075] 單價單元輕鏈核酸序列巧rbitux，序列號4)
[0076] gatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgc egegeg過gcc過g過gc過ttggc過CC過過c過ttc過ttggt過tc過gc過gege過CC過過egge過gcccgcgcctgctg過tt過過 過t過tgcg過geg過過過gc過tt過gegge過ttccg過geegettt過gegge過gegge過gegge過ccg過tttt過ccctg過gc過 tt過過C過gcgtgg過過過geg過過g過t過ttgegg過tt過tt過ttgee過gc過g過過C過過C過過ctggccg過CC過cctttggc