CCAAGCTGGAGCTGAAAGGTGCGGCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGT GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCGGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGAAGTCCGACGGCTCCTTCT TCCTCGCCAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
[0089] 鼠kappa鏈的前導(dǎo)膚序列氨基酸序列（序列號11)
[0090] METDIILLWV化LWVPGSTG
[OOW] 鼠kappa鏈的前導(dǎo)膚序列核酸序列（序列號12)
[0092] atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt
[0093] 2.雙特異性抗體基因克隆
[0094] 選擇pCHOl. 0作為表達載體去克隆和表達抗EGFR的重鏈和輕鏈基因，pCHOl. 0-潮 霉素表達載體是通過用潮霉素抗性基因替換pCHOl. 0載體中的嚷嶺霉素基因改造而來，被 選擇用來克隆和表達抗CD3的ScFv-化融合基因。表1中的引物根據(jù)克隆方案設(shè)計好后， 發(fā)送到蘇州金唯智生物科技有限公司進行合成。W表1中的引物進行PCR擴增，模板為 由金唯智基因合成并克隆到pUC57上的基因質(zhì)粒，包括化bitux和Vectibix的可變區(qū)，然 后分別將抗-EGFR重、輕鏈分別構(gòu)建到pCHOl. 0的表達載體上，將抗CD3ScFv-化構(gòu)建到 pCHOl. 0-潮霉素的表達載體上。
[0095] 表1.雙特異性抗體基因克隆中使用的引物
[0096]
【主權(quán)項】
1. 雙特異性抗體，其特征在于，所述該抗體包含：(a)單價單元，為輕鏈-重鏈對，該 輕鏈-重鏈對針對腫瘤細(xì)胞表面抗原具有特異性結(jié)合能力，優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是 EGFR、⑶20、⑶30和⑶133,更優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是EGFR;和（b)單鏈單元，為融合 肽，該融合肽包含單鏈可變片段ScFv和具有鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc片段， 其中該融合肽針對的免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、NKT細(xì)胞或CIK細(xì)胞；優(yōu)選地，該融合肽對免疫 細(xì)胞表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體，其特征在于：單鏈單元的CH2結(jié)構(gòu)域位于鉸 鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域之間；不包含CHl結(jié)構(gòu)域；單鏈單元的鉸鏈區(qū)位于ScFv和CH2結(jié)構(gòu)域之 間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單鏈可變片段由輕鏈可變區(qū) 和重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域組成，它們都靶向于抗原表位CD3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：在所述單價單元中，輕鏈通過二硫 鍵與重鏈結(jié)合；所述重鏈通過一個或多個二硫鍵與所述融合肽結(jié)合。
5. 權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：單鏈單元包括針對人源CD3的抗體 抗-CD3,單價單元包括針對EGFR的抗體抗-EGFR; 優(yōu)選地，所述抗-EGFR重鏈的氨基酸序列為序列號1所示的氨基酸序列，抗-EGFR的輕 鏈的氨基酸序列為序列號3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFV-Fc的氨基酸序列為 序列號9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重鏈在222位點上的半胱氨酸與抗-EGFR的輕 鏈215位點上的半胱氨酸以二硫鍵的形式連接，所述的抗-EGFR重鏈在228和231位點上的 半胱氨酸與抗-⑶3ScFv-Fc的255和258位點上的半胱氨酸分別以二硫鍵的形式連接，所 述的抗-EGFR重鏈在394和411位點上與抗-⑶3ScFv-Fc的428和397位點上形成鹽橋連 接，所述的抗-EGFR重鏈在368位點上與抗-⑶3ScFv-Fc的436位點上形成隆突-入-穴 連接。 或所述抗-EGFR重鏈的氨基酸序列為序列號5所示的氨基酸序列，抗-EGFR的輕鏈的 氨基酸序列為序列號7所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFV-Fc的氨基酸序列為序列 號9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重鏈在222位點上的半胱氨酸與抗-EGFR的輕鏈214 位點上的半胱氨酸以二硫鍵的形式連接，所述的抗-EGFR重鏈在228和231位點上的半胱 氨酸與抗-⑶3ScFv-Fc的255和258位點上的半胱氨酸分別以二硫鍵的形式連接，所述的 抗-EGFR重鏈在394和411位點上與抗-⑶3ScFv-Fc的428和397位點上形成鹽橋連接，所 述的抗-EGFR重鏈在368位點上與抗-⑶3ScFv-Fc的436位點上形成隆突-入-穴連接。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單價單元中的重鏈包含人或 者人源化的Fc片段，優(yōu)選地，該重鏈的Fc片段包含人IgGlFc片段；所述融合肽的Fc片段 包含人或者人源化的Fc片段，優(yōu)選地，該融合肽的Fc片段包含人IgGlFc片段。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單價單元的人IgGlFc段和所 述單鏈單元的IgGlFc通過鹽橋和隆突-入-穴結(jié)構(gòu)連接。
8. 制備權(quán)利要求1-7中任一項所述雙特異性抗體的方法，其特征在于，所述方法包括 步驟： (1)分別將單價單元的重、輕鏈分別構(gòu)建到第一表達載體上，將單鏈單元構(gòu)建到第二表 達載體上； (2) 將第一和第二表達載體一起共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，培養(yǎng)并取上清； (3) 將表達上清分離得到純化后的雙特異性抗體；優(yōu)選地，所述細(xì)胞是CHO-S細(xì)胞；或 者優(yōu)選地，所述分離步驟包括：蛋白A親和層析柱從表達上清中捕獲所有帶Fc結(jié)構(gòu)域的抗 體，通過SP陽離子交換層析實現(xiàn)目標(biāo)雙特異性抗體與副產(chǎn)物的分離，再過Q柱，最后濃縮置 換緩沖液PBS。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，所述第一表達載體是pCHOl. 0 ;所述第二表達載體是 pCHOl. 0-潮霉素。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述方法的步驟（1)中： 所述單價單元為抗-EGFR抗體，擴增其輕鏈所用引物為Kozak(EcoRV)F，MK-Leader(EcoRV)F，和hlgK(PacI)R，通過重疊PCR擴增，將Kozak序列、前導(dǎo)序列及酶切 位點EcoRV與PacI引入輕鏈；擴增其重鏈所用引物為Kozak(AvrII)F，MK-Leader(AvrI I)F和hlgGl(BstZ17I)R，通過重疊PCR擴增，將Kozak序列、前導(dǎo)序列及酶切位點AvrII 與BstZ17I引入重鏈；將擴增好的LC基因片段與用EcoRV與PacI酶切過的pCHOl. 0表達 載體進行同源重組，獲得裝入抗-EGFR輕鏈的表達載體；然后用AvrII與BstZ17I酶切后再 和HC進行同源重組，獲得抗-EGFR的pCHOl. 0表達載體，帶Erbitux抗體基因的質(zhì)粒命名 為pCHOl. 0-ERB-HL-KKW，或者帶Vectibix抗體基因的質(zhì)粒命名為pCHOl.O-VEC-HL-KKW; 所述單鏈單元為抗-⑶3ScFv-Fc抗體，擴增其所用引物為Kozak(AvrII)F，L2K-VH(MK)F1 和hlgGl(BstZ17I)R，通過PCR擴增抗CD3ScFv-Fc結(jié)構(gòu)域，并將Kozak序 列、前導(dǎo)序列及酶切位點AvrII與BstZ17I引入ScFv-Fc，將擴增好的基因片段與酶切過的 pCHOl. 0-潮霉素表達載體進行同源重組，獲得裝入抗⑶3ScFv-Fc的表達載體，質(zhì)粒命名為 pCHOl. 0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。
11. 權(quán)利要求1-7中任一項所述雙特異性抗體或者按照權(quán)利要求8-10中任一項制備 的雙特異性抗體的方法制備的雙特異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療EGFR 特異抗原表達所引起的腫瘤或相關(guān)疾病，或者用于殺死表達EGFR細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求1-7中任一項所述雙特異性抗體或者按照權(quán)利要求8-10中任一項制備的 雙特異性抗體的方法制備的雙特異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于在腫瘤細(xì)胞 系中篩選用于治療表達EGFR特異抗原的腫瘤細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物或者評價用于治療表達 EGFR特異抗原的腫瘤細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物的藥效。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體，本申請的雙特異性抗體由單鏈單元和單價單元組成，其中該單鏈單元針對免疫細(xì)胞的表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力，該單價單元針對腫瘤細(xì)胞表面抗原EGFR具有特異性結(jié)合能力；該單鏈單元包含與Fc片段融合的單鏈可變片段(ScFv)，該單價單元包含輕鏈和重鏈對。本申請還提供雙特異性抗體的制備方法以及這些抗體的藥學(xué)用途。
【IPC分類】C07K16-30, C07K16-46, A61K39-395, C12N15-85, A61P35-00
【公開號】CN104774268
【申請?zhí)枴緾N201510030519
【發(fā)明人】王濤, 方麗娟, 楊錦霞, 戴晴, 劉勇, 周鵬飛
【申請人】武漢友芝友生物制藥有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年1月21日