>[0024]VL:輕鏈可變區(qū)（li曲tchainvari油leregion)。
[0025]CL;輕鏈恒定區(qū)（^constantregionofli曲tchain)。
[0026]CDR;是英文Complementaritydeterminingregions(CDRs)的縮寫(xiě)，是指抗體的 抗原互補(bǔ)決定區(qū)。
[0027]ScFv;單鏈可變區(qū)抗體片段（single-chainvari油lefragment)，又稱為單鏈抗 體。
[002引 化D:細(xì)胞系開(kāi)發(fā)（celllinedevelopment)
[0029]FACS;巧光激活細(xì)胞分選（Fluorescence-activatedcellsorting)，也稱為流式 細(xì)胞分選術(shù)。
[0030] 本發(fā)明針對(duì)常規(guī)單克隆抗體的不足之處，通過(guò)基因工程和抗體工程的方法進(jìn)行的 新分子-雙特異性抗體的創(chuàng)制，在傳統(tǒng)單克隆抗體主要通過(guò)CDC，ADCC和調(diào)亡能力來(lái)殺傷腫 瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上，增加了介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫療法，大大提高了免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的功 效。
[0031] 具體地，本發(fā)明提供了W下的技術(shù)方案：
[0032] 在一種實(shí)施方式中，提供一種雙特異性抗體，其特征在于，所述該抗體包含；(a) 單價(jià)單元，為輕鏈-重鏈對(duì)，該輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原具有特異性結(jié)合能力， 優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是EGFR、CD20、CD30和CD133,更優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是 EGFR;和化）單鏈單元，為融合膚，該融合膚包含單鏈可變片段ScFv和具有較鏈區(qū)、C肥結(jié) 構(gòu)域和C冊(cè)結(jié)構(gòu)域的化片段，其中該融合膚針對(duì)的免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、NKT細(xì)胞或CIK細(xì) 胞；優(yōu)選地，該融合膚對(duì)免疫細(xì)胞表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力。
[0033] 在一種實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體的單鏈單元的CH2結(jié)構(gòu)域位于ScFv片段和 C冊(cè)結(jié)構(gòu)域之間。
[0034] 在一種實(shí)施方式中，雙特異性抗體的單鏈可變片段由輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)結(jié) 構(gòu)域組成，它們都祀向于抗原表位CD3。
[0035] 在一種實(shí)施方式中，在單價(jià)單元中，輕鏈通過(guò)二硫鍵與重鏈結(jié)合；重鏈通過(guò)一個(gè)或 多個(gè)二硫鍵與所述融合膚結(jié)合。
[0036] 在一種實(shí)施方式中，單鏈單元包括針對(duì)人源CD3的抗體抗-CD3,單價(jià)單元包括 針對(duì)EGFR的抗體抗-EGFR;優(yōu)選地，所述抗-EGFR重鏈的氨基酸序列為序列號(hào)1所示 的氨基酸序列，抗-EGFR的輕鏈的氨基酸序列為序列號(hào)3所示的氨基酸序列，W及所述 抗-CD3ScFv-化的氨基酸序列為序列號(hào)9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重鏈在222位 點(diǎn)上的半脫氨酸與抗-EGFR的輕鏈215位點(diǎn)上的半脫氨酸W二硫鍵的形式連接，所述的 抗-EGFR重鏈在228和231位點(diǎn)上的半脫氨酸與抗-CD3ScFv-化的255和258位點(diǎn)上的半脫 氨酸分別W二硫鍵的形式連接，所述的抗-EGFR重鏈在394和411位點(diǎn)上與抗-CD3ScFv-Fc 的428和397位點(diǎn)上形成鹽橋連接，所述的抗-EGFR重鏈在368位點(diǎn)上與抗-CD3ScFv-Fc 的436位點(diǎn)上形成隆突-入-穴連接；
[0037] 或所述抗-EGFR重鏈的氨基酸序列為序列號(hào)5所示的氨基酸序列，抗-EGFR的輕 鏈的氨基酸序列為序列號(hào)7所示的氨基酸序列，W及所述抗-CD3ScFv-化的氨基酸序列為 序列號(hào)9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重鏈在222位點(diǎn)上的半脫氨酸與抗-EGFR的輕 鏈214位點(diǎn)上的半脫氨酸W二硫鍵的形式連接，所述的抗-EGFR重鏈在228和231位點(diǎn)上的 半脫氨酸與抗-CD3ScFv-化的255和258位點(diǎn)上的半脫氨酸分別W二硫鍵的形式連接，所 述的抗-EGFR重鏈在394和411位點(diǎn)上與抗-CD3ScFv-化的428和397位點(diǎn)上形成鹽橋連 接，所述的抗-EGFR重鏈在368位點(diǎn)上與抗-CD3ScFv-化的436位點(diǎn)上形成隆突-入-穴 連接。
[003引在一種實(shí)施方式中，單價(jià)單元中的重鏈包含人或者人源化的化片段，優(yōu)選地，該 重鏈的化片段包含人IgG化片段；所述融合膚的化片段包含人或者人源化的化片段，優(yōu) 選地，該融合膚的化片段包含人IgG化片段。
[0039] 在一種實(shí)施方式中，所述單價(jià)單元的人IgG化段和所述單鏈單元的IgG化通過(guò) 鹽橋和隆突-入-穴結(jié)構(gòu)連接。
[0040] 在一種實(shí)施方式中，提供一種雙特異性抗體的制備方法，所述方法包括：
[0041] (1)分別將單價(jià)單元的重、輕鏈分別構(gòu)建到第一表達(dá)載體上，將單鏈單元構(gòu)建到第 二表達(dá)載體上；
[0042] (2)將第一和第二表達(dá)載體一起共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，培養(yǎng)并取上清；
[0043] (3)將表達(dá)上清分離得到純化后的雙特異性抗體；優(yōu)選地，所述細(xì)胞是CHO-S細(xì) 胞；或者優(yōu)選地，所述分離步驟包括：蛋白A親和層析柱從表達(dá)上清中捕獲所有帶化結(jié)構(gòu) 域的抗體，通過(guò)SP陽(yáng)離子交換層析實(shí)現(xiàn)目標(biāo)雙特異性抗體與副產(chǎn)物的分離，再過(guò)Q柱，最后 濃縮置換緩沖液PBS。
[0044] 在一種實(shí)施方式中，第一表達(dá)載體是pCHOl. 0 ;第二表達(dá)載體是pCHOl. 0-潮霉素。
[0045] 在一種實(shí)施方式中，所述單價(jià)單元為抗-EGFR抗體，擴(kuò)增其輕鏈所用引物為 Kozak巧coRV)F、MK-Leader(EcoRV)F和hi巧(PacI)R，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增，將Kozak序列、 前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)EcoRV與化cl引入輕鏈；擴(kuò)增其重鏈所用引物為Kozak(AvrII)F、 MK-Leader(AvrII)F和hIgGUBstZ17I)R，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增，將Kozak序列、前導(dǎo)序列及 酶切位點(diǎn)AvrII與BstZ17I引入重鏈；將擴(kuò)增好的LC基因片段與用EcoRV與化cl酶切 過(guò)的pCHOl. 0表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得裝入抗-EGFR輕鏈的表達(dá)載體；然后用AvrII 與BstZ17I酶切后再和肥進(jìn)行同源重組，獲得抗-EGFR的pCHOl. 0表達(dá)載體，帶化bi化X 抗體基因的質(zhì)粒命名為pCHOl. 0-ERB-HL-KKW，或者帶Vectibix抗體基因的質(zhì)粒命名為 pCHOl. 0-VEC-HL-KKW；
[0046] 所述單鏈單元為抗-CD3ScFv-Fc抗體，擴(kuò)增其所用引物為Kozak(AvrII)F， L2K-VH(MK)F1 和hlgGl@stZ17I)R，通過(guò)PCR擴(kuò)增抗CD3ScFv-化結(jié)構(gòu)域，并將Kozak序 列、前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)AvrII與BstZ17I引入ScFv-Fc，將擴(kuò)增好的基因片段與酶切過(guò)的 pCHOl. 0-潮霉素表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得裝入抗CD3ScFv-化的表達(dá)載體，質(zhì)粒命名為 pCHOl. 0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。
[0047] 在一種實(shí)施方式中，上述任一的雙特異性抗體或者按照上述任一方法制備的雙特 異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療EGFR特異抗原表達(dá)所引起的腫瘤或相 關(guān)疾病，或者用于殺死表達(dá)EGFR細(xì)胞。
[0048] 在一種實(shí)施方式中，上述任一的雙特異性抗體或者按照上述任一方法制備的雙特 異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于在人腫瘤細(xì)胞系中篩選用于治療表達(dá)EGFR 特異抗原的腫瘤細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物或者評(píng)價(jià)用于治療表達(dá)EGH?特異抗原的腫瘤細(xì)胞相 關(guān)疾病的藥物的藥效。本發(fā)明還提供了W下的技術(shù)方案：
[00例本發(fā)明提供了一種新方法制備雙特異性抗體MSB0DY(monomerandScFv bispecificantibody)(如圖2所示），該雙特異性抗體包括兩組重輕鏈組合，其中一組特 異結(jié)合一種抗原，并且在其重鏈化區(qū)進(jìn)行一些改造，使其相對(duì)野生型，不易自身形成二聚 體；而另一組特異結(jié)合另一種抗原，同樣在其重鏈化區(qū)進(jìn)行另外一些改造，也不易自身形 成二聚體，而該兩組重輕鏈之間很容易形成雜合二聚體。并且其中一組的抗體結(jié)構(gòu)為單 聚體Ab，另一組為ScFv-Fc，該樣就避免了各自輕鏈與對(duì)方重鏈錯(cuò)配的可能性，從而形成 125KD的雙特異性抗體蛋白分子。化改造后，單聚體Ab的重鏈和單鏈自然異二聚化，同時(shí) 化和CH1間自然二聚化，最后形成MSB0DY，MSB0DY各結(jié)構(gòu)域排列順序及結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2。 [0050] 本發(fā)明中利用W上制備雙特異性抗體的方法，制備雙特異性抗體。其中是WEGFR 和人源CD3為祀點(diǎn)的雙特異性抗體，被命名為EGFRXCD3,如圖2,抗-EGFR該邊為IgG形式， 包括抗-EGFR重鏈與輕鏈，抗-CD3該邊為ScFv-化形式，包括抗-CD3VH、VL、化結(jié)構(gòu)域。W 上雙特異性抗體通過(guò)抗體基因工程方法進(jìn)行構(gòu)建，雙特異性抗體MSB0DY的單聚體Ab重鏈 和單聚體Ab輕鏈二元表達(dá)載體，W及ScFv-Fc表達(dá)載體。根據(jù)LC，肥，ScFv，化基因序列及 載體中的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。其中LC，HC，ScFv和化分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)PCR或重疊 延伸PCR法獲得基因片段，然后通過(guò)同源重組法進(jìn)行克隆。酶切pCHOl. 0或pCHOl. 0-潮霉 素載體，然后純化回收PCR產(chǎn)物和酶切后的載體，分二步分別將LC片段，HC片段同源重組克 隆到pCHOl. 0載體上，ScFv-化片段同源重組克隆到pCHOl. 0-潮霉素載體上，并測(cè)序。重組 蛋白質(zhì)MSB0DY在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)、檢測(cè)，使用轉(zhuǎn)染試劑將分別表達(dá)單價(jià)單元重鏈、 單價(jià)單元輕鏈和單鏈單元的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，再收集上清進(jìn)行SDS-PAGE和 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)MSB0DY的表達(dá)情況。將轉(zhuǎn)染表達(dá)后的培養(yǎng)液上清離屯、，過(guò)濾，用結(jié)合緩沖 液稀釋，過(guò)親和層析柱，洗脫緩沖液洗脫，SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白質(zhì)。
[0化1] 本發(fā)明的技術(shù)方案的有益的技術(shù)效果有；
[0052] 1.本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N異二聚體抗體，該抗體包含兩個(gè)不同的抗原結(jié)合多膚單元。 該異二聚體與其對(duì)應(yīng)的同二聚體分子量大小不同，可利用分子量的大小來(lái)區(qū)別異二聚體和 同二聚體，從而較方便的確定雙特異性抗體的純度。該兩個(gè)抗原結(jié)合多膚單元之一包含類 似于野生型抗體的輕鏈-重鏈對(duì)，在整個(gè)本申請(qǐng)中，該單元也稱為"單價(jià)單元"。另一抗原結(jié) 合多膚單元包含單鏈可變片段（ScFv)。該樣的ScFv可融合至抗體的恒定片段（Fc)。在本 申請(qǐng)全文中此融合膚也被稱為"單鏈單元"。
[0化3] 2.本發(fā)明公開(kāi)了一種新型雙特異性抗體MSB0DY介導(dǎo)的免疫細(xì)胞殺傷體外藥效