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從血漿無創(chuàng)測(cè)定胎兒或腫瘤的甲基化組的制作方法

文檔序號(hào):8460362閱讀:379來源:國(guó)知局
從血漿無創(chuàng)測(cè)定胎兒或腫瘤的甲基化組的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)案的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)案為要求以下各申請(qǐng)案的優(yōu)先權(quán)的PCT申請(qǐng)案:2013年6月3日提交的標(biāo) 題為"在血衆(zhòng)中使用甲基化狀態(tài)和拷貝數(shù)檢測(cè)腫瘤(TumorDetectionInPlasmaUsing MethylationStatusAndCopyNumber)" 的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第 61/830, 571 號(hào);以及 2013年3月15日提交的標(biāo)題為"從血漿無創(chuàng)測(cè)定胎兒或腫瘤的甲基化組(Non-Invasive DeterminationOfMethylomeOfFetusOrTumorFromPlasma)" 的美國(guó)申請(qǐng)案第 13/842, 209號(hào),其為2012年9月20日提交的標(biāo)題為"通過母體血漿的大規(guī)模平行測(cè)序測(cè)定 胎盤的全基因組DNA甲基化狀態(tài)的方法(MethodOfDeterminingTheWholeGenomeDNA MethylationStatusOfThePlacentaByMassivelyParallelSequencingOfMaternal Plasma) "的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第61/703, 512號(hào)的非臨時(shí)申請(qǐng)案并且要求美國(guó)臨時(shí)專利 申請(qǐng)案第61/703, 512號(hào)的權(quán)益,所述申請(qǐng)案以全文引用的方式并入本文中用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般涉及DNA的甲基化模式(甲基化組)的測(cè)定,并且更具體地說,涉及分 析包括來自不同基因組(例如來自胎兒和母親,或來自腫瘤和正常細(xì)胞)的DNA的混合物 的生物樣品(例如血漿)以確定少數(shù)基因組的甲基化模式(甲基化組)。還描述了所測(cè)定 的甲基化組的用途。
【背景技術(shù)】
[0004] 胚胎和胎兒的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程,并且包括一系列高度協(xié)調(diào)的遺傳和表觀遺 傳事件。癌癥的發(fā)展也是一個(gè)復(fù)雜的過程,它通常涉及多個(gè)遺傳和表觀遺傳步驟。發(fā)育過 程的表觀遺傳控制的異常與不孕癥、自然流產(chǎn)、子宮內(nèi)生長(zhǎng)異常和產(chǎn)后結(jié)果相關(guān)。DNA甲基 化是最常研宄的表觀遺傳機(jī)制之一。DNA的甲基化大多發(fā)生在甲基添加到CpG雙核苷酸當(dāng) 中胞嘧啶殘基的5'碳的情況下。胞嘧啶甲基化增添了一層對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和DNA功能的控制。 舉例來說,稱為CpG島的富含CpG雙核苷酸的基因啟動(dòng)子的高甲基化通常與基因功能的抑 制相關(guān)。
[0005] 盡管表觀遺傳機(jī)制在調(diào)節(jié)發(fā)育過程中有著重要的作用,但人類胚胎和胎組織不易 獲得進(jìn)行分析(腫瘤可能類似地不可獲得)。在人類中產(chǎn)前期期間研宄健康和疾病的此類 表觀遺傳過程的動(dòng)態(tài)改變實(shí)際上是不可能的。胚胎外組織,特別是胎盤,可以作為產(chǎn)前診斷 程序的一部分或出生后獲得,其為此類研宄提供了主要途徑之一。但是,此類組織需要侵入 性程序。
[0006] 人類胎盤的DNA甲基化型態(tài)已經(jīng)吸引研宄人員數(shù)十年。人類胎盤顯示了大量與 DNA甲基化有關(guān)的罕見生理特征。在整體水平上,胎盤組織與大部分體細(xì)胞組織比較時(shí)是低 甲基化的。在基因水平上,所選基因座的甲基化狀態(tài)是胎盤組織特定的標(biāo)記。整體與基因 座特定的甲基化型態(tài)都展示了孕齡依賴性改變。印記基因,即表達(dá)依賴于等位基因的親代 來源的基因,在胎盤中起關(guān)鍵作用。胎盤已經(jīng)被描述為假惡性的,并且已經(jīng)觀測(cè)到若干腫瘤 抑制基因的尚甲基化。
[0007] 胎盤組織的DNA甲基化型態(tài)的研宄使得可以了解妊娠相關(guān)或發(fā)育相關(guān)疾?。ɡ?如先兆子癇和子宮內(nèi)生長(zhǎng)受限)的病理生理學(xué)?;蚪M印記上的病癥與例如普拉德-威 利綜合癥(Prader-Willisyndrome)和安格爾曼綜合癥(Angelmansyndrome)等發(fā)育 病癥相關(guān)。已經(jīng)在由輔助的生殖技術(shù)產(chǎn)生的妊娠中觀測(cè)到胎盤和胎組織的基因組印記 和整體DNA甲基化的改變型態(tài)(日浦等人2012人類繁殖;27:2541-2548(HHiuraet al.2012HumR印rod;27:2541-2548))。例如母親吸煙(霍沃思等人2013表觀基因組 學(xué);5:37_49(KEHaworthetal.2013Epigenomics;5:37_49))、母親飲食因素(江等人 2012FASEBJ;26:3563-3574(XJiangetal.2012FASEBJ;26:3563-3574))和母親代謝狀 態(tài)(例如糖尿?。ü热?,糖尿病.(1〇;[:10.2337/(11312-02890^1^」」6丨31.,013&6七68. doi: 10. 2337/dbl2-0289))等大量環(huán)境因素與后代的表觀遺傳異常相關(guān)。
[0008] 盡管努力了數(shù)十年,但是還沒有任何切實(shí)可行的方法可用來研宄胎兒或腫瘤甲基 化組并監(jiān)測(cè)妊娠期間或例如惡性病等疾病過程期間的動(dòng)態(tài)改變。因此,提供無創(chuàng)地分析全 部或部分胎兒甲基化組和腫瘤甲基化組的方法是非常有價(jià)值的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 實(shí)施例提供了用于測(cè)定和使用各種組織和樣品的甲基化型態(tài)的系統(tǒng)、方法和設(shè) 備。提供了實(shí)例說明??梢曰谘獫{甲基化(或具有游離DNA的其它樣品,例如尿液、唾液、 生殖器洗滌液)與母親/患者的甲基化型態(tài)比較來推斷胎兒/腫瘤組織的甲基化型態(tài)。當(dāng) 樣品具有DNA的混合物時(shí),可以使用組織特定的等位基因鑒別來自胎兒/腫瘤的DNA,來確 定胎兒/腫瘤組織的甲基化型態(tài)。甲基化型態(tài)可以用于確定胎兒/腫瘤的基因組中的拷貝 數(shù)變異。通過各種技術(shù)鑒別出胎兒的甲基化標(biāo)記物??梢酝ㄟ^測(cè)定DNA片段的尺寸分布的 尺寸參數(shù)來確定甲基化型態(tài),其中尺寸參數(shù)的參考值可以用于確定甲基化水平。
[0010] 另外,甲基化水平可以用于確定癌癥等級(jí)。在癌癥情況下,血漿中甲基化組改變的 測(cè)量可以允許檢測(cè)癌癥(例如用于篩選目的)、監(jiān)測(cè)(例如檢測(cè)抗癌治療后的反應(yīng);以及檢 測(cè)癌癥復(fù)發(fā))和預(yù)后(例如用于測(cè)量體內(nèi)癌細(xì)胞的負(fù)荷或用于癌癥分期或用于評(píng)估由疾病 或疾病進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性過程引起的死亡機(jī)率)。
[0011] 可以參考以下【具體實(shí)施方式】和附圖來更好地了解本發(fā)明的實(shí)施例的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0012] 圖1A展示表100,為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,母體血液、胎盤和母體血漿的測(cè)序結(jié) 果。
[0013] 圖1B展示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,測(cè)序樣品的1Mb窗口中的甲基化密度。
[0014] 圖2A-2C展示fM直針對(duì)甲基化指數(shù)的曲線圖:㈧母體血細(xì)胞、⑶絨膜絨毛樣 品、(c)足月胎盤組織。
[0015] 圖3A和3B展示從成年男性和非懷孕成年女性收集的血漿和血細(xì)胞中甲基化CpG 位點(diǎn)百分比的柱狀圖:(A)常染色體、(B)染色體X。
[0016] 圖4A和4B展示血細(xì)胞DNA和血漿DNA中對(duì)應(yīng)基因座的甲基化密度的曲線圖:⑷ 非懷孕成年女性、(B)成年男性。
[0017] 圖5A和5B展示從孕婦收集的樣品當(dāng)中甲基化CpG位點(diǎn)百分比的柱狀圖:(A)常 染色體、(B)染色體X。
[0018] 圖6展示母體血液、胎盤和母體血漿的人類基因組的不同重復(fù)序列類別的甲基化 水平的柱狀圖。
[0019] 圖7A展示早期妊娠樣品的Circos圖700。圖7B展示晚期妊娠樣品的Circos圖 750〇
[0020] 圖8A-8D展示針對(duì)提供有用信息的單核苷酸多態(tài)性周圍的CpG位點(diǎn),基因組組織 DNA針對(duì)母體血漿DNA的甲基化密度的比較曲線圖。
[0021] 圖9是一個(gè)流程圖,說明根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,用于從生物體的生物樣品確定第 一甲基化型態(tài)的方法900。
[0022] 圖10是一個(gè)流程圖,說明根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,從生物體的生物樣品中確定第一 甲基化型態(tài)的方法1000。
[0023] 圖11A和11B展示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,使用母體血漿數(shù)據(jù)和胎兒DNA百分比濃 度的預(yù)測(cè)算法的性能圖。
[0024] 圖12A是表1200,展示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例預(yù)測(cè)甲基化的15個(gè)所選基因座的細(xì) 節(jié)。圖12B是圖表1250,展示胎盤中15個(gè)所選基因座的推測(cè)的類別和其在胎盤中對(duì)應(yīng)甲基 化水平。
[0025] 圖13是方法1300的流程圖,所述方法1300用于從懷有至少一個(gè)胎兒的女性個(gè)體 的生物樣品檢測(cè)胎兒染色體異常。
[0026] 圖14是方法1400的流程圖,所述方法1400用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,通過比較 胎盤甲基化型態(tài)與母體甲基化型態(tài)來鑒別甲基化分子標(biāo)記。
[0027] 圖15A是表1500,使用關(guān)于33個(gè)先前報(bào)導(dǎo)的早期妊娠甲基化分子標(biāo)記展示早期妊 娠數(shù)據(jù)的DMR鑒別算法的性能。圖15B是表1550,使用晚期妊娠數(shù)據(jù)并與分娩時(shí)獲得的胎 盤樣品比較展示DMR鑒別算法的性能。
[0028] 圖16是表1600,展示基于母體血漿亞硫酸氫鹽測(cè)序數(shù)據(jù)的直接分析預(yù)測(cè)為高甲 基化或低甲基化的基因座的數(shù)目。
[0029] 圖17A是曲線1700,展示母體血漿、非懷孕女性對(duì)照血漿、胎盤和外周血液DNA的 尺寸分布。圖17B是母體血漿、成年女性對(duì)照血漿、胎盤組織和成年女性對(duì)照血液的尺寸分 布和甲基化型態(tài)的曲線1750。
[0030] 圖18A和18B是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,血漿DNA分子的甲基化密度和尺寸的曲線 圖。
[0031] 圖19A展示成年非懷孕女性的測(cè)序讀數(shù)的甲基化密度和尺寸的曲線1900。圖19B 是圖1950,展示母體血漿中胎兒特定和母體特定的DNA分子的尺寸分布和甲基化型態(tài)。
[0032] 圖20是方法2000的流程圖,所述方法2000用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例,評(píng)估生物 體的生物樣品中DNA的甲基化水平。
[0033] 圖21A是表2100,展示肝細(xì)胞癌(HCC)患者的手術(shù)前血漿和組織樣品的甲基化密 度。圖21B是表2150,展示每一樣品所實(shí)現(xiàn)的序列讀數(shù)的數(shù)目和測(cè)序深度。
[0034] 圖22是表220,展示健康對(duì)照的血漿樣品中常染色體中的甲基化密度,在71. 2% 到72. 5%范圍內(nèi)。
[0035] 圖23A和23B展示HCC患者的白細(xì)胞層、腫瘤組織、非腫瘤肝組織、手術(shù)前血漿和 手術(shù)后血漿的甲基化密度。
[0036] 圖24A是圖2400,展示來自HCC患者的手術(shù)前血漿的甲基化密度。圖24B是曲線 2450,展示來自HCC患者的手術(shù)后血漿的甲基化密度。
[0037] 圖25A和25B展示針對(duì)染色體1,使用四個(gè)健康對(duì)照個(gè)體的血漿甲基化組數(shù)據(jù)作為 參考,HCC患者的手術(shù)前(圖2500)和手術(shù)后(圖2550)血漿樣品的血漿DNA甲基化密度 的z分?jǐn)?shù)。
[0038] 圖26A是表2600,展示手術(shù)前和手術(shù)后血漿的z分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖
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