基因組中的"DNA甲基化"通常是指添加甲基到CpG雙核苷酸中胞嘧 啶殘基的5'碳（即5-甲基胞嘧啶）。DNA甲基化可以發(fā)生在例如CHG和CHH等其它背景 下的胞嘧啶中，其中H是腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。胞嘧啶甲基化也可以呈5-羥基甲基 胞嘧啶形式。還報導了非胞嘧啶甲基化，例如N6-甲基腺嘌呤。
[0075] "組織"對應于任何細胞。不同類型的組織可以對應于不同類型的細胞（例如肝、肺 或血液），但也可以對應于來自不同生物體（母親與胎兒）的組織或健康細胞與腫瘤細胞。 「生物樣品」是指取自個體（例如人類，例如孕婦、癌癥患者或懷疑患有癌癥者、器官移植接 受者或懷疑患有涉及器官的疾病過程的個體（例如心肌梗塞中的心或中風中的腦））并含 有一或多個相關核酸分子的任何樣品。生物樣品可以是體液，例如血液、血漿、血清、尿、陰 道液、子宮或陰道沖洗液、胸膜液、腹水、腦脊髓液、唾液、汗水、淚液、痰液、支氣管肺泡灌洗 液等。也可以使用糞便樣品。
[0076] 術語"癌癥等級"可以指癌癥是否存在、癌癥階段、腫瘤尺寸、是否存在轉移、身體 的總腫瘤負荷和/或癌癥嚴重程度的其它量度。癌癥等級可以是數值或其它特征。等級可 以是零。癌癥等級還包括與突變或多種突變相關的癌變前或癌前期病狀（狀態(tài)）。癌癥等 級可以按各種方式使用。舉例來說，篩選可以檢查已知先前未患癌癥的某人是否存在癌癥。 評估可以研宄已經被診斷為患有癌癥的某人以監(jiān)測癌癥隨時間推移的進展、研宄療法的效 用或確定預后。在一個實施例中，預后可以表示為患者死于癌癥的機率，或在特定持續(xù)時間 或時間后癌癥進展的機率，或癌癥轉移的機率。檢測可以意指'篩選'或可以意指檢查具有 癌癥的暗示性特征（例如癥狀或其它陽性測試）的某人是否患有癌癥。
[0077]發(fā)明詳述
[0078] 表觀遺傳機制在胚胎和胎兒發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。但是，人類胚胎和胎組織 (包括胎盤組織）不容易獲得（美國專利6, 927, 028)。某些實施例已經通過分析具有母體 循環(huán)中存在的游離胎兒DNA分子的樣品解決了此問題。胎兒甲基化組可以用多種方式推 斷。舉例來說，母體血漿甲基化組可以與細胞甲基化組（來自母親的血細胞）比較并且展 示與胎兒甲基化組相關的差異。作為另一實例，可以使用胎兒特定的等位基因確定特定的 基因座上胎兒甲基化組的甲基化。另外，如尺寸與甲基化百分比之間的相關性所展示，片段 的尺寸可以用作甲基化百分比的指示物。
[0079] 在一個實施例中，全基因組亞硫酸氫鹽測序用于在單核苷酸分辨率下分析母體血 漿DNA的甲基化型態(tài)（甲基化組的部分或全部）。通過采用母親與胎兒之間的多態(tài)差異，可 以從母體血液樣品集合胎兒甲基化組。在另一個實施例中，不使用多態(tài)差異，而是可以使用 血漿甲基化組與血細胞甲基化組之間的差異。
[0080] 在另一個實施例中，通過采用腫瘤基因組與非腫瘤基因組之間的單核苷酸變異和 /或拷貝數異常以及來自血漿（或其它樣品）的測序數據，可以在懷疑或已知患有癌癥的 患者的樣品中進行腫瘤的甲基化型態(tài)分析。在與健康對照或一組健康對照的血漿甲基化水 平比較時測試個體的血漿樣品中甲基化水平的差異可以允許鑒別測試個別為患有癌癥。另 外，甲基化型態(tài)可以充當揭露癌癥類型、例如來自哪一器官、個人已經發(fā)展和是否已發(fā)生轉 移的標記。
[0081] 由于此方法具有無創(chuàng)性，故能夠從早期妊娠、晚期妊娠中和產后收集的母體血液 樣品連續(xù)評估胎兒和母體血漿甲基化組。觀測到妊娠相關的改變。所述方法也可以應用于 在中期妊娠期間獲得的樣品。從妊娠期間的母體血漿推斷的胎兒甲基化組類似于胎盤甲基 化組。從母體血漿數據鑒別出印記基因和甲基化有差異的區(qū)域。
[0082] 因此，已經研發(fā)出一種無倉I」、連續(xù)和全面地研宄胎兒甲基化組的方法，因而能夠鑒 別生物標記物或直接測試與妊娠相關的病變。實施例也可以用于無創(chuàng)、連續(xù)和全面地研宄 腫瘤甲基化組，用于篩選或檢測個體是否患有癌癥、用于監(jiān)測癌癥患者中的惡性疾病和用 于預后。實施例可以應用于任何癌癥類型，包括（但不限于）肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前列 腺癌、鼻咽癌、胃癌、睪丸癌、皮膚癌（例如黑色素瘤）、影響神經系統的癌癥、骨癌、卵巢癌、 肝癌（例如肝細胞癌）、血液科惡性疾病、胰腺癌、子宮內膜癌、腎癌、宮頸癌、膀胱癌等。
[0083] 首先論述了如何測定甲基化組或甲基化型態(tài)的描述，隨后描述了不同的甲基化組 (例如胎兒甲基化組、腫瘤甲基化組、母親或患者的甲基化組以及混合的甲基化組，例如來 自血漿）。隨后描述了使用胎兒特定的標記物或通過比較混合的甲基化型態(tài)與細胞甲基化 型態(tài)對胎兒甲基化型態(tài)的測定。胎兒甲基化標記物通過比較甲基化型態(tài)來測定。論述尺寸 與甲基化之間的關系。還提供了甲基化型態(tài)檢測癌癥的用途。
[0084] I.甲基化組的測定
[0085] 無數的方法已經用于研宄胎盤甲基化組，但每種方法都有它的限制性。舉例來說， 亞硫酸氫鈉，一種將未甲基化的胞嘧啶殘基改性成尿嘧啶并保持甲基化的胞嘧啶不變的化 學物質，將胞嘧啶甲基化的差異轉化成基因序列差異以供進一步詢問。研宄胞嘧啶甲基化 的金標法是基于用亞硫酸氫鈉處理組織DNA，接著對經亞硫酸氫鹽轉化的DNA分子的個別 克隆進行直接測序。在分析DNA分子的多個克隆后，可以獲得每個CpG位點的胞嘧啶甲基 化模式和定量型態(tài)。但是，克隆的亞硫酸氫鹽測序是低通量與勞動密集型程序，不易在全基 因組規(guī)模上應用。
[0086] 通常消化未甲基化DNA的甲基化敏感性限制酶提供了一種研宄DNA甲基化的低成 本方法。但是，由此類研宄產生的數據局限于具有酶識別基元的基因座并且結果不是定量 的。由抗甲基化胞嘧啶抗體結合的DNA的免疫沉淀可以用于研宄基因組的大區(qū)段，但往往 會偏向具有稠密甲基化的基因座，因為抗體結合于此類區(qū)域的強度更高?；谖㈥嚵械姆?法依賴于用于研宄的探針的先驗設計和探針與標靶DNA之間的雜交效率。
[0087] 為了全面地研宄甲基化組，一些實施例使用大規(guī)模平行測序（MPS)基于每個核苷 酸和每個等位基因來提供全基因組信息和甲基化水平的定量評估。近來，先亞硫酸氫鹽 轉化后全基因組MPS已經變得可行（李斯特等人2008細胞；133:523-536(RListeret al2008Cell; 133:523-536))。
[0088] 在少量的將全基因組亞硫酸氫鹽測序應用于研宄人類甲基化組的已發(fā)表研宄 (李斯特等人 2〇〇9 自然；462:315_322(RListeretal.2〇〇9Nature;462:3l5_322);勞 倫特等人 2010 基因組研宄；20:320-331(Laurentetal.2010GenomeRes;20:320-331); 李等人2010美國科學公共圖書館?生物學；8:el000533(YLietal.2010PLoSBiol; 8:el000533);和庫里斯等人 2012 自然遺傳；44:1236-1242(MKulisetal.2012Nat Genet;44:1236-1242))中，兩個研宄集中于胚胎干細胞和胎兒成纖維細胞（李斯特等人 2009自然；462:315-322 ;勞倫特等人2010基因組研宄；20:320-331)。兩個研宄都分析細 胞系來源的DNA。
[0089] A?全基因組亞硫酸氫鹽測序
[0090] 某些實施例可以解決前述的挑戰(zhàn)并能夠全面、無創(chuàng)和連續(xù)地研宄胎兒甲基化組。 在一個實施例中，將全基因組亞硫酸氫鹽測序用于分析在孕婦血液循環(huán)中發(fā)現的游離胎兒DNA分子。盡管血漿DNA分子的豐度低和片段性，我們仍能夠從母體血漿組裝高分辨率胎兒 甲基化組并觀測到隨著妊娠進展相關的連續(xù)改變。假定對無創(chuàng)產前測試（NIPT)的興趣非 常濃厚，實施例可以提供一種用于發(fā)現胎兒生物標記的強大的新工具，或充當實現胎兒或 妊娠相關疾病的NIPT的直接平臺。目前提供了來自各種樣品的全基因組亞硫酸氫鹽測序 的數據，從其中可以得出胎兒甲基化組。在一個實施例中，此項技術可以應用于并發(fā)有先兆 子癇或子宮內生長遲緩或早產的孕婦中的甲基化型態(tài)分析。對于此類妊娠并發(fā)癥，因為其 無創(chuàng)性，此項技術可以連續(xù)使用從而允許監(jiān)測和/或預后和/或監(jiān)測對治療作出的反應。
[0091] 圖1A展示表100,為根據本發(fā)明的實施例，母體血液、胎盤和母體血漿的測序結 果。在一個實施例中，對以下各者的經亞硫酸氫鹽轉化的DNA文庫進行全基因組測序，所述 DNA文庫是使用甲基化DNA文庫銜接子（伊路米那（Illumina))(李斯特等人2008細胞； 133:523-536)制備：早期妊娠收集的血液樣品的血細胞、CVS、分娩時收集的胎盤組織、早 期妊娠和晚期妊娠以及產后時期期間收集的母體血漿樣品。還分析從一個成年男性和一個 成年非懷孕女性獲得的血細胞和血漿DNA樣品。在這一研宄中，產生總共95億對的原始序 列讀數。每個樣品的測序覆蓋度展示在表100中。
[0092] 對于早期妊娠、晚期妊娠和產后母體血漿樣品，可唯一性地比對到人類參考基因 組的序列讀數分別達到50倍、34倍和28倍的平均單倍體基因組覆蓋度。對于從孕婦獲得 的樣品，基因組中CpG位點的覆蓋率在81%到92%范圍內。針對早期妊娠、晚期妊娠和產 后母體血漿樣品，橫跨CpG位點的序列讀數分別等于每鏈33倍、每鏈23倍和每鏈19倍的 平均單倍體覆蓋率。所有樣品的亞硫酸氫鹽轉化效率>99. 9% (表100)。
[0093] 表100中，不明確率（標記"a"）是指同時比對到參考人類基因組的沃森（Watson) 和克里克（Crick)鏈的讀數的比例。A轉化率是指內部對照ADNA通過亞硫酸氫鹽處理而 轉化成"胸腺嘧啶"殘基占未甲基化胞嘧啶的比例。H-般等于A、C或T。"a"是指可以映 射到特定基因座但無法分配給沃森或克里克鏈的讀數。"b"是指具有一致起始和結束座標 的成對讀數。對于"c"，XDNA在亞硫酸氫鹽轉化前添加到每個樣品中。X轉化率是指在 亞硫酸氫鹽轉化后轉化成"胸腺嘧啶"的胞嘧啶核苷酸的比例，并且用作成功亞硫酸氫鹽轉 化率的指示。"d"是指存在于參考人類基因組中并且在亞硫酸氫鹽轉化后保持為胞嘧啶序 列的胞嘧啶核苷酸的數目。
[0094] 在亞硫酸氫鹽改性期間，未甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶并隨后在PCR擴增后轉 化成胸腺嘧啶，而甲基化胞嘧啶將保持完整（弗羅梅爾等人1992美國國家科學院院刊； 89:1827-31(MFro_eretal.l992ProcNatlAcadSciUSA;89:1827-31))。在測序和 比對后，個別CpG位點的甲基化狀態(tài)可以根據CpG序列中的胞嘧啶殘基的甲基化序列讀數 "M"（甲基化）的計數和未甲基化序列讀數"U"（未甲