89. -種從生物體的生物樣品確定第一甲基化型態(tài)的方法，所述生物樣品包括包含源 自第一組織和第二組織的游離DNA分子的混合物的游離DNA，所述方法包含： 從所述生物樣品分析多個(gè)DNA分子，其中分析DNA分子包括： 確定所述生物體的基因組中所述DNA分子的位置； 確定所述DNA分子的基因型； 確定所述DNA分子在一或多個(gè)位點(diǎn)是否甲基化； 鑒別多個(gè)第一基因座，其滿足與所述第一組織的第一基因組相應(yīng)的第一等位基因和相 應(yīng)的第二等位基因是雜合的并且所述第二組織的第二基因組相應(yīng)的第一等位基因是純合 的； 對(duì)于所述第一基因座中的每一者： 對(duì)于與所述基因座相關(guān)的一或多個(gè)位點(diǎn)的每一者： 確定在所述位點(diǎn)上甲基化并對(duì)應(yīng)于所述基因座的所述相應(yīng)第二等位基因的DNA分子 的數(shù)目； 基于在所述基因座的所述一或多個(gè)位點(diǎn)上甲基化并對(duì)應(yīng)于所述基因座的所述相應(yīng)第 二等位基因的DNA分子的所述數(shù)目以計(jì)算甲基化密度； 從所述第一基因座的所述甲基化密度產(chǎn)生所述第一組織的所述第一甲基化型態(tài)。
90. 如權(quán)利要求89所述的方法，其中所述生物樣品來自懷有胎兒的女性個(gè)體，并且其 中所述第一組織來自所述胎兒或胎盤并且所述第二組織對(duì)應(yīng)于所述女性個(gè)體。
91. 如權(quán)利要求89所述的方法，其中所述位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CpG位點(diǎn)。
92. 如權(quán)利要求89所述的方法，其中每個(gè)基因座包括至少一個(gè)CpG位點(diǎn)。
93. 如權(quán)利要求89所述的方法，其中每個(gè)基因座靠近至少一個(gè)CpG位點(diǎn)。
94. 一種用于分析生物樣品中的胎兒DNA的試劑盒，所述生物樣品含有胎兒DNA和來自 懷有胎兒的女性個(gè)體的DNA的混合物，所述試劑盒包含： 一或多種寡核苷酸能與表S2A、S2B、S2C、S2D、S3A、S3B、S3C和S3D中的所列的基因組 區(qū)域的至少一部分特定性雜交。
95. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述寡核苷酸中，至少一種是與所述基因組 某一區(qū)域的至少一部分相對(duì)應(yīng)的引物。
96. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述寡核苷酸中，至少一種是與所述基因組 某一區(qū)域的至少一部分相對(duì)應(yīng)的探針。
97. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含： 一或多種甲基化敏感性限制酶。
98. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種甲基化敏感性限制酶中，至少 一種切割低甲基化的DNA分子。
99. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種甲基化敏感性限制酶中，至少 一種切割高甲基化的DNA分子。
100. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種寡核苷酸中，至少一種是選自 表S2A〇
101. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種寡核苷酸中，至少一種是選自 表S2B〇
102. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種寡核苷酸中，至少一種是選自 表S2C〇
103. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種寡核苷酸中，至少一種是選自 表S2D〇
104. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種寡核苷酸中，至少一種是選自 表S3A〇
105. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種寡核苷酸中，至少一種是選自 表S3B〇
106. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種寡核苷酸中，至少一種是選自 表S3C〇
107. 如權(quán)利要求94所述的試劑盒，其中在所述一或多種寡核苷酸中，至少一種是選自 表S3D〇
108. -種評(píng)估生物體的生物樣品中DNA的甲基化水平的方法，所述方法包含： 對(duì)于多個(gè)尺寸中的每個(gè)尺寸： 測量與所述尺寸相對(duì)應(yīng)的來自所述生物樣品的多個(gè)DNA片段的量； 基于多個(gè)尺寸下DNA片段的所述量，用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算第一參數(shù)的第一值，所述第一 參數(shù)提供所述生物樣品中DNA片段的尺寸型態(tài)的統(tǒng)計(jì)量度； 將所述第一尺寸值與參考尺寸值比較，所述參考尺寸值由參考樣品的DNA片段計(jì)算； 以及 基于所述比較評(píng)估所述甲基化水平。
109. 如權(quán)利要求108所述的方法，其中測量與所述尺寸相對(duì)應(yīng)的DNA片段的量包括： 對(duì)于來自所述生物樣品的所述多個(gè)DNA片段的每一者： 測量所述DNA片段的尺寸， 其中測量DNA片段的尺寸包括： 對(duì)所述DNA片段進(jìn)行雙末端測序以獲得成對(duì)序列讀數(shù)； 將所述成對(duì)序列讀數(shù)與參考基因組比對(duì)；以及 使用所述比對(duì)位置確定所述DNA片段的所述尺寸。
110. 如權(quán)利要求109所述的方法，其中通過只從與特定區(qū)域比對(duì)的DNA片段確定所述 第一尺寸值，所述甲基化水平對(duì)應(yīng)于所述特定區(qū)域。
111. 如權(quán)利要求108所述的方法，其中測量與所述尺寸相對(duì)應(yīng)的DNA片段的量包括使 用電泳。
112. 如權(quán)利要求108所述的方法，其中所述參考樣品是在所述生物樣品的之前從所述 生物體中所獲得，其中所述評(píng)估的甲基化水平是指與所述第一尺寸值相對(duì)于所述參考尺寸 值所增加或降低的量相對(duì)應(yīng)的相對(duì)水平。
113. 如權(quán)利要求108所述的方法，其中所述參考尺寸值是校準(zhǔn)曲線的一部分。
114. 如權(quán)利要求108所述的方法，其中所述甲基化水平是甲基化密度。
115. 如權(quán)利要求114所述的方法，其中所述甲基化密度是針對(duì)CpG位點(diǎn)。
116. -種從生物體的生物樣品檢測染色體異常的方法，所述生物樣品包括包含源自第 一組織和第二組織的游離DNA分子的混合物的游離DNA，所述方法包含： 從所述生物樣品分析多個(gè)DNA分子，其中分析DNA分子包括： 確定參考基因組中所述DNA分子的位置； 確定所述DNA分子在一或多個(gè)位點(diǎn)上是否甲基化； 對(duì)于多個(gè)位點(diǎn)中的每一者： 確定在所述位點(diǎn)上甲基化的DNA分子的相應(yīng)數(shù)目； 基于所述第一染色體區(qū)域內(nèi)的位點(diǎn)上甲基化的DNA分子的所述相應(yīng)數(shù)目，計(jì)算第一染 色體區(qū)域的第一甲基化水平； 將所述第一甲基化水平與第一閾值比較； 基于所述比較確定所述第一組織中所述第一染色體區(qū)域的異常的分類。
117. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中將所述第一甲基化水平與閾值比較包括： 將所述第一甲基化水平標(biāo)準(zhǔn)化并將所述標(biāo)準(zhǔn)化第一甲基化水平與所述閾值比較。
118. 如權(quán)利要求117所述的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)化是指使用第二染色體區(qū)域的第二甲 基化水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
119. 如權(quán)利要求117所述的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)化是指使用來自所述第一組織的游離 DNA的百分比濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
120. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中計(jì)算第一甲基化水平包括： 鑒別所述生物體的基因組的多個(gè)區(qū)域； 鑒別每一所述區(qū)域內(nèi)的一或多個(gè)位點(diǎn)； 計(jì)算每個(gè)區(qū)域的區(qū)域甲基化水平，其中所述第一甲基化水平是針對(duì)第一區(qū)域，以及 其中將所述第一甲基化水平與第一閾值比較包括： 將每一所述區(qū)域甲基化水平與相應(yīng)區(qū)域的閾值比較； 確定區(qū)域甲基化水平超出所述相應(yīng)區(qū)域閾值的區(qū)域的第一數(shù)目；以及 將所述第一數(shù)目與閾值以確定所述分類。
121. 如權(quán)利要求120所述的方法，其中所述閾值是百分比，并且其中將所述第一數(shù)目 與閾值比較包括： 在與所述閾值比較前，將區(qū)域的所述第一數(shù)目除以區(qū)域的第二數(shù)目。
122. 如權(quán)利要求121所述的方法，其中區(qū)域的所述第二數(shù)目是指所鑒別的所述多個(gè)區(qū) 域全部。
123. 如權(quán)利要求120所述的方法，其中所述相應(yīng)區(qū)域閾值是來自參考甲基化水平的指 定量。
124. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述生物樣品來自懷有胎兒的女性個(gè)體，其中 所述第一組織來自胎兒或胎盤并且所述第二組織來自所述女性個(gè)體，并且其中所述染色體 異常是胎兒染色體異常。
125. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述閾值是指基于與來自所述女性個(gè)體的所述 第二組織的DNA相關(guān)的背景甲基化水平。
126. 如權(quán)利要求124所述的方法，其中所述閾值從懷有無染色體異常的胎兒的其它女 性懷孕個(gè)體針對(duì)所述第一染色體區(qū)域確定。
127. 如權(quán)利要求124所述的方法，其中所述染色體異常是指第21對(duì)染色體三體癥或第 18對(duì)染色體三體癥或第13對(duì)染色體三體癥或特納綜合癥（Turnersyndrome)或克氏綜合 癥（Klinefeltersyndrome)〇
128. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述第一組織來自所述生物體內(nèi)的腫瘤并且所 述第二組織來自所述生物體的非惡性組織。
129. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述閾值由未患癌癥的其它生物體確定。
130. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中閾值是基于所述生物樣品中源自所述第一組織 的游離DNA的濃度。
131. 如權(quán)利要求130所述的方法，其中所述閾值是基于與異常類型相對(duì)應(yīng)的比例因 子，其中所述異常類型是缺失或重復(fù)。
132. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中確定所述DNA分子在參考基因組中所在的所述 位置包括確定所述位置是否在所述第一染色體區(qū)域內(nèi)。
133. 如權(quán)利要求132所述的方法，其中確定所述DNA分子在所述參考基因組中所在的 所述位置是通過確定所述DNA分子是否比對(duì)到所述第一染色體區(qū)域內(nèi)來實(shí)現(xiàn)。
134. 如權(quán)利要求116所述的方法，其中所述染色體異常是亞染色體缺失或亞染色體重 復(fù)或迪喬治綜合癥OiGeorgesyndrome) 〇
【專利摘要】本實(shí)施例提供了測定并使用各種組織和樣品的甲基化型態(tài)的系統(tǒng)、方法和設(shè)備。因闡述發(fā)明的需要，我們提供了相關(guān)的實(shí)例說明?；谘獫{DNA甲基化(或具有游離DNA的其它樣品，例如尿液、唾液、生殖器洗滌液等)與母親/患者的甲基化型態(tài)的比較來推斷胎兒/腫瘤組織的甲基化型態(tài)。當(dāng)樣品具有DNA混合物時(shí)，可以使用組織特定的等位基因以鑒別來自胎兒/腫瘤的DNA，來確定胎兒/腫瘤組織的甲基化型態(tài)。甲基化型態(tài)可以用于確定胎兒/腫瘤的基因組中的拷貝數(shù)變異。通過各種技術(shù)鑒別出胎兒的甲基化標(biāo)記物?？梢酝ㄟ^確定DNA片段的尺寸分布的尺寸參數(shù)來確定甲基化型態(tài)，其中所述尺寸參數(shù)的參考值可以用于確定甲基化水平。另外，甲基化水平可以用于確定癌癥等級(jí)。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104781422
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380058654
【發(fā)明人】趙慧君, 陳君賜, 盧煜明, 倫妙芬, 江培勇, 陳渭雯
【申請(qǐng)人】香港中文大學(xué)
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2013年9月20日
【公告號(hào)】CA2884066A1, EP2898100A1, WO2014043763A1