基化）的計(jì)數(shù)推斷得到。使用亞硫酸 氫鹽測(cè)序數(shù)據(jù)，構(gòu)筑母體血液、胎盤(pán)和母體血漿的整個(gè)甲基化組?？梢允褂靡韵碌仁接?jì)算母 體血漿中特定基因座的平均甲基化CpG密度（又稱(chēng)為甲基化密度MD):
[0095]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分析生物體的生物樣品的方法，所述生物樣品包括源自正常細(xì)胞和可能來(lái)自與 癌癥相關(guān)的細(xì)胞的核酸分子，其中在所述生物樣品中至少一些所述核酸分子是游離的核酸 分子，所述方法包含： 從所述生物樣品分析多個(gè)DNA分子，其中分析DNA分子包括： 確定所述DNA分子在所述生物體的基因組中的位置； 確定所述DNA分子在一或多個(gè)位點(diǎn)是否甲基化； 對(duì)于多個(gè)位點(diǎn)中的每一者： 確定在所述位點(diǎn)上甲基化的DNA分子的相應(yīng)數(shù)目； 基于在所述多個(gè)位點(diǎn)上甲基化的DNA分子的所述相應(yīng)數(shù)目計(jì)算第一甲基化水平； 將所述第一甲基化水平與第一閾值比較； 基于所述比較，確定癌癥等級(jí)的第一分類(lèi)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中確定所述DNA分子在一或多個(gè)位點(diǎn)上是否甲基化包 括： 進(jìn)行可識(shí)別甲基化的的測(cè)序。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中進(jìn)行可識(shí)別甲基化的測(cè)序包括： 用亞硫酸氫鈉處理所述DNA分子；以及 對(duì)所述經(jīng)處理的DNA分子進(jìn)行測(cè)序。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述用亞硫酸氫鈉處理所述游離DNA分子是用于檢 測(cè)5-羥基甲基胞嘧啶的Tet輔助的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化或氧化亞硫酸氫鹽測(cè)序的一部分。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中每個(gè)區(qū)域的DNA分子的所述相應(yīng)數(shù)目可通過(guò)比對(duì)從 所述可識(shí)別甲基化的測(cè)序中獲得的序列讀數(shù)來(lái)確定。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中確定所述DNA分子在一或多個(gè)位點(diǎn)上是否甲基化包 括使用甲基化敏感性限制酶消化、甲基化特定的PCR、甲基化依賴(lài)性的DNA沉淀、甲基化DNA 結(jié)合蛋白/肽或無(wú)需亞硫酸氫鈉處理的單分子測(cè)序。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含： 對(duì)于所述基因組的第一多個(gè)區(qū)域中的每一者： 確定來(lái)自所述區(qū)域的DNA分子的相應(yīng)數(shù)目； 計(jì)算所述相應(yīng)數(shù)目的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化值； 將所述相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化值與參考值比較以確定所述相應(yīng)區(qū)域顯示缺失還是擴(kuò)增； 對(duì)確定為含有缺失或擴(kuò)增的區(qū)域的第一量進(jìn)行確定； 將所述第一量與第一閾值比較以確定癌癥等級(jí)的第二分類(lèi)；以及 使用所述第一分類(lèi)和所述第二分類(lèi)以確定癌癥等級(jí)的第三分類(lèi)。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第一閾值是用于確定缺失或擴(kuò)增的所述第一多 個(gè)區(qū)域的百分比。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中僅僅當(dāng)所述第一分類(lèi)與所述第二分類(lèi)都指示癌癥 時(shí)，所述第三分類(lèi)才是癌癥陽(yáng)性。
10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中當(dāng)所述第一分類(lèi)或所述第二分類(lèi)指示癌癥時(shí)，所述 第三分類(lèi)是癌癥陽(yáng)性。
11. 如權(quán)利要求1或7所述的方法，其中所述第一分類(lèi)指示所述生物體存在癌癥，所述 方法進(jìn)一步包含： 通過(guò)將所述第一甲基化水平與從其它生物體確定的對(duì)應(yīng)值的比較，鑒別與所述生物體 相關(guān)的癌癥類(lèi)型，其中所述其它生物體中的至少兩個(gè)被鑒別為患有不同類(lèi)型的癌癥。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第三分類(lèi)指示所述生物體存在癌癥，所述方 法進(jìn)一步包含： 通過(guò)將區(qū)域的所述第一量與從所述其它生物體確定的對(duì)應(yīng)值的比較，鑒別與所述生物 體相關(guān)的所述癌癥類(lèi)型。
13. 如權(quán)利要求1或7所述的方法，其中計(jì)算所述第一甲基化水平包括： 鑒別所述基因組的第二多個(gè)區(qū)域； 鑒別各個(gè)所述區(qū)域內(nèi)的一或多個(gè)位點(diǎn)； 計(jì)算每個(gè)區(qū)域的區(qū)域甲基化水平，其中所述第一甲基化水平是針對(duì)第一區(qū)域， 所述方法進(jìn)一步包含： 所述區(qū)域甲基化水平每一者與相應(yīng)區(qū)域閾值比較，其包括將所述第一甲基化水平與所 述第一閾值比較； 對(duì)區(qū)域甲基化水平確定為超過(guò)所述相應(yīng)區(qū)域閾值的區(qū)域的第二量進(jìn)行確定；以及 將區(qū)域的所述第二量與第二閾值比較以確定所述第一分類(lèi)。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中確定區(qū)域甲基化水平超過(guò)所述相應(yīng)區(qū)域閾值的所 述區(qū)域?qū)?yīng)于第一組區(qū)域，所述方法進(jìn)一步包含： 將所述第一組區(qū)域的區(qū)域甲基化水平與其它生物體關(guān)于所述第一組區(qū)域的對(duì)應(yīng)區(qū)域 甲基化水平比較，所述其它生物體具有如下所述的生物體中的至少兩者：第一類(lèi)型的癌癥、 不存在癌癥和第二類(lèi)型的癌癥；以及 基于所述比較，確定所述生物體是否具有所述第一類(lèi)型的癌癥、不存在癌癥或所述第 二類(lèi)型的癌癥。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其進(jìn)一步包含： 基于所述第一組區(qū)域的所述區(qū)域甲基化水平將所述其它生物體聚類(lèi)，其中所述類(lèi)中的 兩者對(duì)應(yīng)于以下任兩者：所述第一類(lèi)型的癌癥、不存在癌癥和所述第二類(lèi)型的癌癥， 其中利用所述區(qū)域甲基化水平的所述比較以確定所述生物體屬于哪一類(lèi)。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述其它生物體的所述聚類(lèi)使用所述生物體的所 述區(qū)域甲基化水平。
17. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述類(lèi)包括與所述第一類(lèi)型的癌癥相對(duì)應(yīng)的第一 類(lèi)、與所述第二類(lèi)型的癌癥相對(duì)應(yīng)的第二類(lèi)和與不存在癌癥相對(duì)應(yīng)的第三類(lèi)。
18. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述其它生物體的所述聚類(lèi)進(jìn)一步基于所述其它 生物體的第二組區(qū)域的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化值，所述第二組區(qū)域?qū)?yīng)于確定為含有缺失或擴(kuò)增的區(qū) 域，其中區(qū)域的所述相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化值是由來(lái)自所述區(qū)域的DNA分子的相應(yīng)數(shù)目確定，所述方 法進(jìn)一步包含： 對(duì)于所述第二組區(qū)域中的每一者： 確定來(lái)自所述區(qū)域相應(yīng)的DNA分子數(shù)目； 從所述相應(yīng)數(shù)目來(lái)計(jì)算相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化值；以及 將所述生物體的所述第二組區(qū)域的所述相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化值與所述其它生物體的所述相應(yīng) 標(biāo)準(zhǔn)化值比較以確定所述生物體屬于哪一類(lèi)的一部分。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述其它生物體的所述聚類(lèi)進(jìn)一步基于高甲基化 的CpG島的相應(yīng)甲基化密度，所述方法進(jìn)一步包含： 對(duì)于所述高甲基化的CpG島每一者： 確定相應(yīng)甲基化密度， 將所述生物體的所述高甲基化的CpG島的所述相應(yīng)甲基化密度與所述其它生物體的 所述甲基化密度比較以確定所述生物體屬于哪一類(lèi)的一部分。
20. 如權(quán)利要求13所述的方法，其進(jìn)一步包含： 對(duì)于所述第二多個(gè)區(qū)域中的每一者： 計(jì)算所述區(qū)域甲基化水平與所述相應(yīng)區(qū)域閾值之間的相應(yīng)差異；以及 計(jì)算與所述相應(yīng)差異相對(duì)應(yīng)的相應(yīng)概率； 其中確定區(qū)域的所述第二量包括： 計(jì)算包括所述相應(yīng)概率的累積分?jǐn)?shù)。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中計(jì)算所述累積分?jǐn)?shù)包括： 利用所述相應(yīng)概率的對(duì)數(shù)以獲得相應(yīng)對(duì)數(shù)結(jié)果；以及 計(jì)算包括所述相應(yīng)對(duì)數(shù)結(jié)果的總和。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述累積分?jǐn)?shù)是所述相應(yīng)對(duì)數(shù)結(jié)果的所述總和的 負(fù)值。
23. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中每個(gè)差異可以被所述相應(yīng)區(qū)域閾值相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)差 所標(biāo)準(zhǔn)化。
24. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述相應(yīng)概率對(duì)應(yīng)于根據(jù)統(tǒng)計(jì)分布所述相應(yīng)差異 的概率。
25. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第二閾值對(duì)應(yīng)于來(lái)自參考組別的最高累積分 數(shù)。
26. 如權(quán)利要求13所述的方法，其進(jìn)一步包含： 對(duì)于所述第一多個(gè)區(qū)域中的每一者： 計(jì)算所述相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化值與所述參考值之間的相應(yīng)差異；以及 計(jì)算與所述相應(yīng)差異相對(duì)應(yīng)的相應(yīng)概率； 其中確定區(qū)域的所述第一量包括： 計(jì)算包括所述相應(yīng)概率的第一總和。
27. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述相應(yīng)區(qū)域閾值是來(lái)自參考甲基化水平的指定 量。
28. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第二閾值是百分比，并且其中比較區(qū)域的所 述第二量與第二閾值包括： 在與所述第二閾值比較前，將區(qū)域的所述第二量除以所述第二多個(gè)區(qū)域的第二數(shù)目。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述第二數(shù)目對(duì)應(yīng)于所述第二多個(gè)區(qū)域全部。
30. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一多個(gè)區(qū)域與所述第二多個(gè)區(qū)域相同，并 且其中所述相應(yīng)區(qū)域閾值依賴(lài)于所述相應(yīng)區(qū)域顯示缺失還是擴(kuò)增。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中與未顯示擴(kuò)增時(shí)相比，所述相應(yīng)區(qū)域顯示擴(kuò)增時(shí) 相應(yīng)區(qū)域閾值具有更大量值，并且其中與未顯示缺失時(shí)相比，所述相應(yīng)區(qū)域顯示缺失時(shí)相 應(yīng)區(qū)域閾值具有更小量值。
32. 如權(quán)利要求31所述的方法，其中相應(yīng)區(qū)域閾值測(cè)試所述第二多個(gè)區(qū)域的低甲基 化，其中與未顯示擴(kuò)增時(shí)相比，所述相應(yīng)區(qū)域顯示擴(kuò)增時(shí)相應(yīng)區(qū)域閾值具有更大負(fù)值，并且 其中與未顯示缺失時(shí)相比，所述相應(yīng)區(qū)域顯示缺失時(shí)，相應(yīng)區(qū)域閾值具有更小負(fù)值。
33. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述生物樣品在治療前采集，所述方法進(jìn)一步包 含： 針對(duì)在治療后采集的另一生物樣品，重復(fù)如權(quán)利要求13所述的方法，以獲得： 確定顯示缺失或擴(kuò)增的區(qū)域的后續(xù)第一量；以及 確定區(qū)域甲基化水平超過(guò)所述相應(yīng)區(qū)域閾值的區(qū)域的后續(xù)第二量； 將所述第一量與所述后續(xù)第一量比較并且將所述第二量與所述后續(xù)第二量比較以確 定所述生物體的預(yù)后。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中將所述第一量與所述后續(xù)第一量比較并且將所述 第二量與所述后續(xù)第二量比較以確定所述生物體的所述預(yù)后包括： 確定所述第一量與所述后續(xù)第一量之間的第一差異； 將所述第一差異與一或多個(gè)第一差異閾值比較； 確定所述第二量與所述后續(xù)第二量之間的第二差異；以及 將所述第二差異與一或多個(gè)第二差異閾值比較。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中當(dāng)所述第一差異低于一個(gè)第一差異閾值時(shí)，與所 述第一差異超過(guò)所述一個(gè)第一差異閾值時(shí)相比，預(yù)測(cè)所述預(yù)后將變得更壞，并且其中當(dāng)所 述第二差異低于一個(gè)第二差異閾值時(shí)，與所述第二差異超過(guò)所述一個(gè)第二差異閾值時(shí)相 比，預(yù)測(cè)所述預(yù)后將變得更壞。
36. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述一個(gè)第一差異閾值和所述一個(gè)第二差異閾值 是零。
37. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述治療是免疫療法、手術(shù)、放射線療法、化學(xué)療 法、基于抗體的療法、表觀遺傳療法或靶向療法。
38. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一閾值是與由獲自健康生物體的生物樣品 建立的參考甲基化水平的指定距離。
39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述指定距離是相對(duì)所述參考甲基化水平的標(biāo)準(zhǔn) 偏差的指定數(shù)目。
40. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一閾值由參考甲基化水平建立，所述參考甲 基化水平是從在所述生物樣品測(cè)試前獲得的所述生物體的先前生物樣品確定。
41. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述第一甲基化水平與所述第一閾值的比較包 括： 確定所述第一甲基化水平與參考甲基化水平之間的差異；以及 將所述差異與對(duì)應(yīng)于所述第一閾值比較。
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