一種鉛-纖維蛋白原螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及重金屬離子的免疫學(xué)檢測(cè)，具體設(shè)及一種鉛-纖維蛋白原馨合物及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維蛋白原（fibrinogen,Fg)其生理功能主要是作為凝血因子I而直接參與凝 血過(guò)程。在凝血共同途徑中，凝血酶先裂解纖維蛋白原兩條Aa鏈氨基端Argl6-Glyl7釋 放出一對(duì)纖維蛋白原膚A，形成纖維蛋白原單體I ;在裂解纖維蛋白原兩條B0鏈氨基端 Argl4-Glyl5釋放出一對(duì)纖維蛋白原膚B，形成纖維蛋白原單體II，暴露纖維蛋白原單體的 聚合部位，通過(guò)非共價(jià)結(jié)合，形成了不穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白原單體。在活化的凝血因子 XIII及Ca"的作用下，纖維蛋白原單體互相交聯(lián)，生成穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白原，并將血 液的有形成分包繞其中，形成牢固的血栓。
[0003]除參與凝血外，纖維蛋白原還具有其他多種功能，如與血小板膜糖蛋白IIb/IIIa結(jié)合而介導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化及腫瘤血行轉(zhuǎn)移等；纖維蛋白原水平還影 響血液粘度，尤其近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)血漿纖維蛋白原水平升高是屯、腦血管、血栓性疾病的重 要危險(xiǎn)因素。血漿纖維蛋白原也是急性時(shí)相蛋白，在很多應(yīng)激狀況下，如感染、嚴(yán)重外傷等 也可短時(shí)間內(nèi)升高。
[0004] 鉛在體內(nèi)的含量超過(guò)一定水平就會(huì)對(duì)健康引起難W恢復(fù)的損害，它可W鉛煙，鉛 塵和各種氧化物形式被人體經(jīng)呼吸道和消化道攝入體內(nèi)，通過(guò)與巧離子的競(jìng)爭(zhēng)作用，氧化 損傷，細(xì)胞調(diào)亡等機(jī)制，引起W神經(jīng)、消化、造血系統(tǒng)障礙為主的全身性、漸進(jìn)性、持久性不 可逆性疾病，而且其危害還可能遺傳到下一代。貧血是鉛中毒的早期癥狀之一，鉛可抑制血 紅素合成過(guò)程中許多酶的活性。鉛中毒可致血管疫李、腹絞痛、視網(wǎng)膜小動(dòng)脈疫李和高血 壓，時(shí)常導(dǎo)致細(xì)小動(dòng)脈硬化。鉛的腎損害常表現(xiàn)為間質(zhì)性腎炎或萎縮性腎炎等病變，腎小管 重吸收功能下降是早期的癥狀。鉛接觸還可能影響生殖功能，接觸鉛的女性發(fā)生不孕癥、流 產(chǎn)及死胎的機(jī)率增多，并可通過(guò)胎盤(pán)轉(zhuǎn)移到胎兒身上。經(jīng)口鉛中毒者肝臟為主要受損器官 之一，可引起肝腫大呈現(xiàn)黃痘，甚至肝硬變或肝壞死，肝損害可能是肝內(nèi)小動(dòng)脈疫李引起 局部缺血所致。鉛引起化咐代謝障礙、抑制含琉基酶，干擾植物神經(jīng)。
[0005] 目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道鉛可W作用于全身各個(gè)系統(tǒng)中的蛋白，從而影響機(jī)體各組 織器官的機(jī)能，已報(bào)道的蛋白包括：腎臟組織中的蛋白、腦組織中的蛋白、紅細(xì)胞中的蛋白、 肝臟組織中的蛋白、腸道組織中的蛋白、肺組織中的蛋白、金屬硫蛋白等。
[0006] 研究發(fā)現(xiàn)發(fā)鉛測(cè)定誤差大，齒鉛、骨鉛及組織鉛取材不易，而尿鉛主要反映鉛排泄 情況。2006年中國(guó)《兒童高鉛血癥和鉛中毒預(yù)防指南》規(guī)定，兒童血鉛水平的篩查可W采用 末梢血或靜脈血，但診斷必須采用靜脈血。但影響機(jī)體免疫球蛋白的蛋白結(jié)合鉛的含量從 未有過(guò)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)鉛污染嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉛-纖維蛋白原馨合物及其 制備方法，并建立鉛-纖維蛋白原馨合物的定性、定量檢測(cè)方法，W便定量檢測(cè)鉛-纖維蛋 白原馨合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉛污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群全血中鉛-纖 維蛋白原馨合物，可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受鉛污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)鉛 污染程度。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是；提供一種鉛-纖維蛋白原馨合物， 該鉛-纖維蛋白原馨合物是鉛離子與纖維蛋白原通過(guò)琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的鉛-纖維蛋白原馨合物的制備方法，即體外合成法，包 括W下步驟：
[0010] A)鉛-纖維蛋白原塞合物的合成；在提純?cè)从谌梭w的纖維蛋白原或按照生物學(xué)方 法重組的纖維蛋白原中加入鉛離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0011] B)鉛-纖維蛋白原馨合物純化；采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中未 反應(yīng)的纖維蛋白原、特異性抗體和鉛離子，即得鉛-纖維蛋白原馨合物。
[0012] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括W下步驟：
[0013] (1)溶解樣品；將上述步驟A)的鉛-纖維蛋白原馨合物溶解于生理鹽水中，得 鉛-纖維蛋白原馨合物溶液；
[0014] 似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維 蛋白原特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0015] 所述能與纖維蛋白原特異性結(jié)合的填料為吸附有可與纖維蛋白原特異性結(jié)合物 質(zhì)的硅膠或樹(shù)脂；
[0016] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)所述溶液，然后上柱，使纖 維蛋白原與填料特異性結(jié)合；
[0017] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線(xiàn)平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2冊(cè)〇4溶液進(jìn)行洗脫；
[0018] (5)收集；收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0019] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0020] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉛特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0021] 所述能與鉛特異性結(jié)合的填料為吸附有可與鉛特異性結(jié)合物質(zhì)的硅膠或樹(shù)脂； [002引 做上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟做中樣本，然后上柱；
[0023] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線(xiàn)平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2冊(cè)〇4溶液進(jìn)行洗脫；
[0024] (10)收集；收集步驟巧）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[002引 （11)透析；將步驟（10)的洗脫液裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立次后，4°C透 析過(guò)夜，收集樣本，即得鉛-纖維蛋白原馨合物。
[0026] 作為優(yōu)選，上述鉛-纖維蛋白原馨合物的制備方法，還包括W下對(duì)鉛-纖維蛋白原 馨合物的鑒定步驟，具體包括W下步驟：
[0027] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[002引 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的鉛-纖維蛋白原馨合物，加入上樣緩沖液， 并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[002引 做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0030] (4)檢測(cè)；在膠床上找出含有鉛的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS檢測(cè)是否含有鉛W及檢測(cè)鉛的含量。
[0031] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉛-纖維蛋白原馨合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)鉛-纖維蛋 白原馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉛-纖維蛋白原馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑 盒。
[0033] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)或捕獲 金屬鉛的物質(zhì)。
[0034] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)鉛-纖維蛋白原馨合物的方法，W已知含量的上述的 鉛-纖維蛋白原馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián) 免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鉛-纖維蛋 白原馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉛-纖維蛋白原馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純 鉛-纖維蛋白原馨合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜 或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[00巧]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0036] 1.本發(fā)明首次合成鉛-纖維蛋白原馨合物；
[0037] 2.本發(fā)明首次提出鉛-纖維蛋白原馨合物可用于制備檢測(cè)血樣中鉛-纖維蛋白原 馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
[003引 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了鉛-纖維蛋白原馨合物的特異性識(shí)別和定量檢測(cè)，W便定量檢測(cè) 人群全血中鉛-纖維蛋白原馨合物的含量，W評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉛污染程度的應(yīng)用，為工業(yè)地 區(qū)的鉛污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的鉛-纖維蛋白原馨合物定量檢測(cè)方法的準(zhǔn)確 度高、重復(fù)性好。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為本發(fā)明所述的鉛-纖維蛋白原馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0040] 圖2為本發(fā)明所述的鉛-纖維蛋白原馨合物的電泳條帶的同步福射X線(xiàn)巧光分析 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0042] 本發(fā)明除特別說(shuō)明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說(shuō)明，均視為可從市購(gòu)方式購(gòu)得：
[0043] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0044] 捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)為可與纖維蛋白原特異性結(jié)合的物質(zhì)，可通過(guò)市售獲得， 如貨號(hào)為"NovusA-0577"的人纖維蛋白原抗體Anti-humanFibrinogen,W下實(shí)施方式中， 所述與纖維蛋白原特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗纖維蛋白原抗體、抗FG抗體均為捕獲纖維蛋白原 的物質(zhì)；
[0045] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0046] 稀釋緩沖液為抑9.6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例：取1. 5g的化和 2. 93g的Na肥〇3溶解加d地2〇定容至1000血；
[0047] 洗漆緩沖液為抑7.4的0. 15MPBS溶液，配制方法示例：取0.2g的皿2口〇4、2.90g 的化2冊(cè)〇4? 12&0、8.Og的NaCl、0.2g的KC1、0. 5mLTween-20,溶解加dd&O定容至 1000血； [004引封閉液為牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.Ig牛血清白蛋白，加入洗漆緩 沖液稀釋定容至lOOmL;
[0049] 終止液為2MH2SO4,配制方法示例：取178. 3血的d地2〇,加濃H2SO4定容至200血；
[0050] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0.5mL濃度為2g/L的甲基聯(lián)苯 胺己醇溶液，加底物稀釋液稀釋至lOmL;