pInc;
[0153] 透析袋的預(yù)處理；將透析袋放入500血的邸TA-NaHC〇3溶液中，煮沸l(wèi)Omin;傾棄 邸TA-NaHC〇3溶液，用d地2〇輕輕漂洗，再用500血5mmol/L邸TA煮沸l(wèi)Omin;棄掉煮沸液，徹 底用d地2〇清洗，加入大量的d地2〇浸泡透析袋4°C過夜。使用時(shí)，戴上手套，取出透析袋， 用大量的dd&O徹底沖洗其內(nèi)外表面；
[0154] 制備鉛-纖維蛋白原馨合物的方法，包括W下步驟：
[0155]A)鉛-纖維蛋白原塞合物的合成；在人源的纖維蛋白原中加入鉛離子進(jìn)行馨合反 應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0巧6] 1)取2.OmgITC邸溶于2mLDMS0中；
[0157] 2)緩慢將步驟1制備的液體加入纖維蛋白原溶液中，邊滴加邊震蕩，于25°C， l(K)r/min的搖床中作用2化，然后用透析袋透析2化，除去未與纖維蛋白原結(jié)合的ITCBE;
[0158] 3)將透析所得的液體用Imol/L肥1調(diào)節(jié)抑值至7. 0,然后緩慢逐漸滴加80y1 Immol/L鉛離子溶液，邊滴加邊振蕩，W免鉛離子使蛋白變性沉淀；
[0159] 4)將加好的溶液在25°C，lOOr/min的搖床中反應(yīng)化，用處理好的透析袋進(jìn)行透析 2化；
[0160] 5)將透析好的液體于-20°C分裝保存，得到鉛-纖維蛋白原馨合物的反應(yīng)溶液。
[0161]B)鉛-纖維蛋白原馨合物純化；采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中 未反應(yīng)的纖維蛋白原、特異性抗體和鉛離子，即得鉛-纖維蛋白原馨合物，具體包括W下步 驟：
[0162] (1)溶解樣品；將上述步驟A)的鉛-纖維蛋白原馨合物溶解于生理鹽水中，得 鉛-纖維蛋白原馨合物溶液；
[0163] (2)平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維 蛋白原特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0164] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)所述溶液，然后上柱，使纖 維蛋白原與填料特異性結(jié)合；
[0165] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2冊(cè)〇4溶液進(jìn)行洗脫；
[0166] (5)收集；收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0167] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0168] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉛特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0169] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0170] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 化2冊(cè)〇4溶液進(jìn)行洗脫；
[0171] (10)收集；收集步驟巧）的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[017引（11)透析；將步驟（10)的洗脫液裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立次后，4°C透 析過夜，收集樣本，即得鉛-纖維蛋白原馨合物。
[0173] C)對(duì)鉛-纖維蛋白原塞合物的鑒定，具體步驟如下：
[0174] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)制備膠床；
[017引 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的鉛-纖維蛋白原馨合物，復(fù)溶于生理鹽水 中，取出8yL加入2yL上樣緩沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0176] (3)電泳；連接電泳板，加電泳緩沖液進(jìn)行電泳；電泳過程中，電流為22mA恒流，環(huán) 境溫度為4°C;至漠酪藍(lán)移至膠底部時(shí)停止電泳，圖1為本發(fā)明所述鉛-纖維蛋白原塞合物 的非變性電泳條帶圖；
[0177] (4)檢測(cè)；在膠床上找出含有鉛的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS檢測(cè)是否含有鉛W及檢測(cè)鉛的含量。
[0178] D)鑒定結(jié)果
[0179] 1)AAS檢測(cè)結(jié)果
[0180] 取步驟C)分離出的蛋白條帶溶液，W石墨爐原子吸收光譜法（AA巧初步測(cè)定纖維 蛋白原中重金屬鉛的含量，如下表所示，W(NH4)2S04溶液為空白對(duì)照；
[0181] 表1纖維蛋白原中鉛的含量
[0182]
[0183] 2)同步福射X巧光分析
[0184] 蛋白條帶內(nèi)微量元素含量的SRXRF分析在北京正負(fù)電子對(duì)撞機(jī)任EPC)的4W1" 同步福射束線上完成。儲(chǔ)存環(huán)中電子束流能量為2. 2GeV，束流強(qiáng)度100mA。樣品移動(dòng)臺(tái) (TSA200型，北京卓立漢光公司）可在計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)下沿X、Y二維方向上移 動(dòng)W改變?nèi)肷涔獍呶恢茫苿?dòng)步長(zhǎng)為0. 0025mm。從樣品發(fā)射出的X射線由Si(Li)探測(cè)器 (PGTInc.LS30143-D巧探測(cè)，探頭與入射SR線共平面且相互垂直，距樣品照射點(diǎn)20mm，信 號(hào)用PGT多道分析儀（MCA4000)獲取輸出。用11.化eV的單色同步福射光激發(fā)樣品，調(diào)節(jié) 入射光斑（lmmx3mm)位置使之處于條帶一端，在300s的測(cè)定時(shí)間內(nèi)，光斑一直沿條帶均勻 緩慢移動(dòng)，計(jì)數(shù)結(jié)束時(shí)光斑移到該條帶另一端。沿電泳方向每1mm取一個(gè)譜。采用AXIL 軟件處理數(shù)據(jù)，并用來源于空氣且含量恒定的Ar信號(hào)峰對(duì)其它元素峰進(jìn)行歸一處理，W抵 消束流強(qiáng)度變化對(duì)信號(hào)強(qiáng)弱產(chǎn)生的影響。在相同的條件下w同樣的方式測(cè)量定量標(biāo)準(zhǔn)干膠 膜的巧光譜。
[0185] 圖2為本發(fā)明所述的鉛-纖維蛋白原馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分析 圖，圖中橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置，縱坐標(biāo)為該條帶各金屬能量（含量）值。 陽18引檢測(cè)條件的確定
[0187] 1.抗纖維蛋白原抗體、抗化抗體最佳工作濃度W及血漿的最佳稀釋倍數(shù)的確定。
[018引酶聯(lián)免疫法檢測(cè)鉛-纖維蛋白原馨合物的方法，具體包括W下步驟：
[0189] 1)包被；將抗纖維蛋白原抗體蛋白包被于固相載體上，分別用稀釋緩沖液將包被 蛋白W1 ;1000、1 ;2000、1 ;4000和1 ;8000的倍比稀釋，加入化ISA板微孔中，每個(gè)濃度包 被S排，4°C保存18小時(shí)；
[0190] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加入封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，洗 漆；
[0191] 3)加待測(cè)樣本；用稀釋緩沖液將待測(cè)血漿樣本按1 ;20、1 ;40、1 ;80的倍比稀釋， 加至微孔中，W已知含量的鉛-纖維蛋白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照，加 至微孔中，37°C作用1小時(shí)；
[0192] 4)加抗化抗體；移去待測(cè)血漿樣本，洗漆，加入用稀釋緩沖液按1 ;50000、1; 100000、1、200000和1 ;400000的倍比稀釋的抗Pb抗體，37°C作用1小時(shí)，使其與纖維蛋白 原上的金屬鉛反應(yīng)；
[0193] 5)加酶標(biāo)；移去抗化抗體，洗漆，加入用稀釋緩沖液稀釋的HRP酶標(biāo)抗體，37°C作 用1小時(shí)，使其與抗化抗體反應(yīng)；
[0194] 6)底物溫育；移去酶標(biāo)抗體，洗漆，加入底物，37°C避光作用30min，加入終止液；
[0195] 7)檢測(cè)；于450nm波長(zhǎng)下在酶標(biāo)儀上分別讀取標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)血漿、陽性對(duì)照、陰性 對(duì)照和空白對(duì)照樣本的0D值。
[0196] 本實(shí)施例中，采用本發(fā)明提供的鉛-纖維蛋白原馨合物標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照，分 別W不加待測(cè)血漿作為陰性對(duì)照1，即依次加入了抗纖維蛋白原抗體、封閉液、抗化抗體、 酶標(biāo)抗體和底物；
[0197]W不加抗Pb抗體的對(duì)照試驗(yàn)組作為陰性對(duì)照2,即依次加入了抗纖維蛋白原抗 體、封閉液、待測(cè)血漿、酶標(biāo)抗體和底物；
[019引 W不加酶標(biāo)抗體的對(duì)照試驗(yàn)組作為陰性對(duì)照3、即依次加入了抗纖維蛋白原抗體、 封閉液、待測(cè)血漿、抗Pb抗體和底物；
[0199]W同時(shí)不加待測(cè)樣本和抗Pb抗體的對(duì)照試驗(yàn)組作為陰性對(duì)照4,即依次加入了抗 纖維蛋白原抗體、封閉液、酶標(biāo)抗體和底物；
[0200] W不加抗纖維蛋白原抗體作的對(duì)照試驗(yàn)組為空白對(duì)照1，即加入了封閉液、待測(cè)血 漿、抗化抗體、酶標(biāo)抗體和底物；
[0201]W及W只加底物的對(duì)照試驗(yàn)組為空白對(duì)照2,W只加PBS的對(duì)照試驗(yàn)組為空白對(duì) 照3。
[0202] 表2為不同抗纖維蛋白原抗體稀釋倍比、血漿稀釋倍比、抗Pb抗體稀釋倍比的樣 本0D值數(shù)據(jù)，
[0203] 表2不同抗纖維蛋白原抗體、抗Pb抗體W及血漿稀釋倍比下的檢測(cè)結(jié)果
[0204]
[0205] 從表2可知，抗纖維蛋白原抗體的稀釋倍比為1:2000時(shí)，樣本OD值大于平行條件 下的其它抗纖維蛋白原抗體的稀釋倍比；該組樣本中，血漿稀釋倍比為1:40時(shí)，抗化抗體 稀釋倍比為1:50000時(shí)，0D值最大，為0. 731。
[0206] 表3為抗纖維蛋白原抗體的稀釋倍比為1:2000、血漿稀釋倍比為1:40、抗化抗體 稀釋倍比為1:50000時(shí)的相對(duì)應(yīng)的陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的0D檢測(cè)值，
[0207] 表3陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果 [020引
[0209] 從表3可知，陰性對(duì)照組0D檢測(cè)值小于0. 1，說明該優(yōu)化條件下，本方法的系統(tǒng)誤 差性小，滿足分析方法要求，所W選此值所對(duì)應(yīng)的濃度作為最佳工作濃度。
[0210] 2.ELISA洗脫液最佳工作濃度及洗脫時(shí)間確定
[0211] 為尋求最適宜的洗脫條件，通過酶聯(lián)免疫法在抗Pb抗體與酶標(biāo)抗體溫育后，W不 同濃度的洗脫液進(jìn)行洗脫，再通過酶標(biāo)儀檢測(cè)0D值，具體步驟如下：
[0212] (1)包被；將抗Pb抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液按1 ;50000的倍比稀釋， 加入ELISA板微孔中，4°C保存16小時(shí)；
[021引 似封閉：移去稀釋緩沖液，洗漆后，加封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并洗 漆；
[0214] (3)加酶標(biāo)抗體；移去封閉液，洗漆后，加入用稀釋緩沖液稀釋至抗體濃度為 2 y g/mL的HRP酶標(biāo)抗體，37°C作用2小時(shí)，使其與抗化