抗體反應(yīng)；
[0215] (4)洗脫；移去酶標(biāo)抗體，用稀釋緩沖液對洗脫液進行稀釋，使洗脫液中木瓜蛋白 酶的濃度：酶標(biāo)抗體中抗體的濃度=1:80、1:40、1:20、1:10、1:5，分別放置于37°C溫度下 作用lh、2h、化；移去洗脫液，洗漆，待洗漆完成后，加入底物，37°C避光作用30分鐘，加終止 液終止反應(yīng)；
[0引引 妨于450nm的檢測波長下在酶標(biāo)儀上分別讀取每個微孔的0D值，具體結(jié)果參見 表4，
[0217]表4不同洗脫液稀釋倍數(shù)下的檢測結(jié)果 [021 引
[0219] 通過比較0D值，W判斷化ISA孔壁上結(jié)合的抗Pb抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物洗脫程 度，當(dāng)0D值最低時，抗化抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物洗脫程度達到最大。如表4所示，當(dāng)洗脫 液中木瓜蛋白酶的濃度：酶標(biāo)抗體中抗體的濃度=1:20時；而作用時間為lh、2h、化時，各 組0D值變化不大，可見隨著時間的延長，酶活力逐漸減弱，在酶濃度不變的情況下，延長消 化時間并不能提高消化率，所W本實驗中洗脫液的作用時間為1-化皆可，綜上所述，我們 選擇洗脫液1:20作為最適工作濃度，1-化作為最適洗脫時間。
[0220] 應(yīng)用實施例 。2引]麻用連施巧I1
[0222] 采用酶聯(lián)免疫法巧LISA法）檢測100份標(biāo)本血漿中的鉛-纖維蛋白原馨合物，即 采用具體實施例方法一記載的方法檢測，具體操作步驟如下：
[0223] 1)包被；將抗纖維蛋白原抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋至2000倍， 加入ELISA板微孔中，37°C保存1小時后于冰箱中4°C儲存；
[0224] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，洗漆， ELISA板37°C放置1小時后于冰箱中4°C儲存；
[022引扣加樣；W標(biāo)本血漿作為待測樣本，W已知含量的鉛-纖維蛋白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn) 品，用稀釋緩沖液將待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均稀釋至40倍，加至微孔中，37°C作用1小時；
[0226] 4)加抗化抗體；移去樣品，洗漆，加入用稀釋緩沖液稀釋至50000倍的抗化抗體， 37°C作用1小時，使其與纖維蛋白原上的金屬鉛反應(yīng)；
[0227] 5)加酶標(biāo)；移去抗化抗體，洗漆，加入抗體濃度為2yg/mL的酶標(biāo)抗體，37°C作用 1小時，使其與抗化抗體反應(yīng)；
[022引 6)底物溫育；移去酶標(biāo)抗體，洗漆，加入底物，37°C避光作用30min，加入終止液至 每一微孔；
[022引 7)檢測；于450nm波長下在酶標(biāo)儀上分別讀取待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的0D值，結(jié)果如 表5所不。
[0230] 表5方法一對100份標(biāo)本血漿的實測結(jié)果
[0231]
[0232] 本應(yīng)用實施例1中，步驟7)中，也可W不使用酶標(biāo)儀檢測，而是直接通過顯色進行 定性檢測。 陽23引 應(yīng)用連施傷I2
[0234] 采用酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法巧LISA法+AAS法）檢測100份標(biāo)本血漿中 鉛-纖維蛋白原馨合物，即采用具體實施例方法二記載的方法檢測，具體操作步驟如下：
[0235] 1)包被；將抗纖維蛋白原抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋包被蛋白至 2000倍，加入化ISA板微孔中，4°C過夜18小時；
[0236] 2)封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，洗漆， ELISA板4°C下保存；
[0237] 3)加樣；W標(biāo)本血漿作待測樣本，W已知含量的鉛-纖維蛋白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品， 用稀釋緩沖液將待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至40倍，加至微孔中，37°C作用1-2小時；
[02測 4)洗脫；移去待測血漿樣本，洗漆，加入0. 8mol/L的化2冊04溶液，37°C作用2小 時；
[0239] 5)檢測；從化ISA微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測馨合于纖維蛋白原上的鉛， 結(jié)果如表6所示。
[0240] 表6方法二對100份標(biāo)本血漿的實測結(jié)果
[0241]
。24引麻用連施例3；
[0243] 采用酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法巧LISA法+ICP-MS法）檢測100 份標(biāo)本血漿中鉛-纖維蛋白原馨合物，即采用具體實施例方法=記載的方法檢測，具體操 作步驟如下：
[0244] 1)包被；將抗纖維蛋白原抗體包被于固相載體上，用稀釋緩沖液稀釋包被蛋白至 2000倍，加入ELISA板微孔中，4°C保存18小時；
[024引。封閉；移去稀釋緩沖液，洗漆，加封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，洗漆，ELISA板4°C保存；
[0246]扣加樣；W標(biāo)本血漿作待測樣本，W已知含量的鉛-纖維蛋白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品， 用稀釋緩沖液將待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至40倍，加至微孔中，37°C作用2小時；
[0247] 4)洗脫；移去待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，洗漆，加入用稀釋緩沖液稀釋至木瓜蛋白酶濃 度為lOOng/mL的洗脫液，37°C洗脫2小時；
[024引5)酸化；在溶液中加入硝酸對溶液進行酸化，封口過夜，徹底酸化，加入過氧化 氨，并且加熱趕酸；
[0249] 6)檢測；取樣，于電感禪合等離子體質(zhì)譜儀下檢測馨合于纖維蛋白原上的鉛，結(jié) 果如表7所不。
[0巧0] 表7方法=對100份標(biāo)本血漿的實測結(jié)果
[0巧 1]
[0252] 上述實施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能W此來限定本發(fā)明保護的范圍， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所 要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種鉛-纖維蛋白原螯合物，其特征在于，該鉛-纖維蛋白原螯合物是鉛離子與纖維 蛋白原通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。2. 如權(quán)利要求1所述的鉛-纖維蛋白原螯合物的制備方法，包括以下步驟： A) 鉛-纖維蛋白原鰲合物的合成：在提純源于人體的纖維蛋白原或按照生物學(xué)方法重 組的纖維蛋白原中加入鉛離子進行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液； B) 鉛-纖維蛋白原螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中未反應(yīng) 的纖維蛋白原、特異性抗體和鉛離子，即得鉛-纖維蛋白原螯合物。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于， 所述步驟B)中具體包括以下步驟： (1) 溶解樣品：將上述步驟A)的鉛-纖維蛋白原螯合物溶解于生理鹽水中，得鉛-纖 維蛋白原螯合物溶液； (2) 平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維蛋白 原特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱； (3) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)所述溶液，然后上柱，使纖維蛋 白原與填料特異性結(jié)合； (4) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HPO^f液進行洗脫； (5) 收集：收集步驟⑷的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原； (6) 透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C 透析過夜，收集樣本； (7) 平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與鉛 特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱； (8) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱； (9) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的Na2HPO4 溶液進行洗脫； (10) 收集：收集步驟（9)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原； (11) 透析：將步驟（10)的洗脫液裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透析過 夜，收集樣本，即得鉛-纖維蛋白原螯合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鉛-纖維蛋白原螯合物的制備方法，其特征在于，步驟B)后 還包括步驟C):對鉛-纖維蛋白原螯合物的鑒定； 其中，步驟C)中具體包括以下步驟： (1) 制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床； (2) 加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉛-纖維蛋白原螯合物，加入上樣緩沖液，并混 勻，然后加樣于樣品槽中； (3) 電泳：連接電泳板，進行電泳； (4) 檢測：在膠床上找出含有鉛的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解，然 后再采用ICP-MS或AAS檢測是否含有鉛以及檢測鉛的含量。5. -種如權(quán)利要求1所述的鉛-纖維蛋白原螯合物在制備檢測血樣中鉛-纖維蛋白原 螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。6. -種至少包括如權(quán)利要求1所述的鉛-纖維蛋白原螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有捕獲纖維 蛋白原的物質(zhì)或捕獲金屬鉛的物質(zhì)。8. -種定量檢測鉛-纖維蛋白原螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權(quán)利要求 1所述的鉛-纖維蛋白原螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 鉛-纖維蛋白原螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉛-纖維蛋白原螯合物與原子吸收光譜結(jié) 合法、提純鉛-纖維蛋白原螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原 子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種鉛-纖維蛋白原螯合物及其制備方法和應(yīng)用，該鉛-纖維蛋白原螯合物是鉛離子與纖維蛋白原通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成，可用于制備檢測人體鉛-纖維蛋白原螯合物的試劑。本發(fā)明首次證實了鉛離子可直接作用于纖維蛋白原。本發(fā)明建立了鉛-纖維蛋白原螯合物的定性定量檢測方法，以檢測一個地區(qū)人群體內(nèi)纖維蛋白原的含量，從而間接反映一個地區(qū)鉛污染程度以及對人群的健康影響。本發(fā)明建立的鉛-纖維蛋白原螯合物定量檢測方法準(zhǔn)確度高重、復(fù)性好。
【IPC分類】C07K14/75, C07K1/22, G01N33/86, G01N33/96
【公開號】CN104987386
【申請?zhí)枴緾N201510413238
【發(fā)明人】張積仁, 陽帆, 董欣敏, 吳婧, 蔡睿, 孫遙, 趙乙木
【申請人】上海拜豪生物科技有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月14日