一種重組慢病毒及其在制備治療可卡因成癮的藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種重組慢病毒及其在制備治療可卡因成癒的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[000引可卡因（Cocaine)又稱古柯堿，化學名為苯甲酯甲基芽子堿（methyl benzoylecgonine)，一般呈白色晶體狀，無臭，味苦而麻，其最早用于局部麻醉和治療哮 喘，是最強的天然中樞興奮劑，因其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮作用而導致濫用，1985年起成為 世界性主要毒品之一。
[0003] 可卡因成癒，是一種慢性復發(fā)性腦部疾病，屬于藥物依賴（化Ug(kpendence)類疾 病，可卡因成癒會引起大腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化，相關(guān)腦區(qū)包括伏隔核、紋狀體、前額 皮質(zhì)、海馬和腹側(cè)被蓋區(qū)，健康也受到多方面的危害，包括精神顏廢、人格缺損、屯、智功能素 亂、并發(fā)相應的感染合并癥W及吸毒者不顧一切地尋求和使用毒品而誘發(fā)各種違法犯罪活 動。
[0004] 可卡因成癒的主要特點表現(xiàn)為即使患者在知曉用藥的嚴重后果后，依然強迫性索 取和使用W滿足欲望、對藥物的尋覓和索取失去控制、對事物失去興趣、成癒記憶十分深 亥IJ，即使經(jīng)過戒斷治療若干年后，接觸與成癒有關(guān)的刺激（如毒友、與過去用藥有關(guān)的環(huán)境 等）都可能誘發(fā)復吸。
[0005] 鑒于可卡因成癒危害甚大，找到合適的治療祀點和藥物，治療可卡因成癒迫在眉 睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一類治療可卡因成癒的藥物。
[0007] PRMT1:蛋白精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶1。
[0008] PRMT1抑制劑：抑制蛋白精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶1的酶活或者表達的物質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明提供了一種沉默PRMT1表達的基因治療劑。
[0010] 首先，本發(fā)明提供了一種核巧酸序列，其核巧酸序列如下：
[0011]TGCTGAGGACATGACATCCAAACTCGAGTTTGGATGTCATGTCCTCAGCTTTTTC(沈QIDNO. 1)。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種核巧酸序列，其核巧酸序列如下：
[001 引TCGAGAAAAAGCTGAGGACATGACATCCAAACTCGAGTTTGGATGTCATGTCCTCAGCA(SEQID NO. 2)ο
[0014] 本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒，其特征在于：它包括沈QIDNO. 1和沈QIDNO. 2 所述核巧酸序列的重組質(zhì)粒。
[0015] 優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒是重組化LU2G質(zhì)粒。進一步優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒的核巧 酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種重組慢病毒，它包含前述任意一項的重組質(zhì)粒。
[0017] 本發(fā)明還提供了前述的核巧酸序列、重組質(zhì)?；蛑亟M慢病毒在制備PRMTl抑制劑 中的用途。
[0018] 本發(fā)明還提供了前述的核巧酸序列、重組質(zhì)?；蛑亟M慢病毒在制備可卡因成癒的 藥物中的用途。
[0019] 優(yōu)選地，所述藥物是降低H4R3me2a的表達水平的藥物。進一步優(yōu)選地，所述藥物 是降低基因Cdk5和CaMKII的表達水平的藥物。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種治療可卡因成癒的藥物，它是W前述的核巧酸序列、重組質(zhì) 粒或重組慢病毒為活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而成的制劑。
[0021] 優(yōu)選地，所述制劑是注射制劑。
[0022] 本發(fā)明沈QIDNO. 1和沈QIDNO. 2所示shRNA、包含前述shRNA的重組質(zhì)粒 化LU2G-shPrmtl-3W及包含該重組質(zhì)粒的重組慢病毒LV-shPRMTl，可W沉默PRMT1基因， 下調(diào)PRMT1的表達，進而降低H4R3me2aW及可卡因成癒相關(guān)基因(Mk5和CaMKII的表達， 可W制備成為治療可卡因成癒的藥物，臨床應用前景良好。
[0023]W下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0024] 圖1小鼠條件性位置偏愛箱
[0025] 圖2自發(fā)活動檢查箱.
[0026] 圖 3M:lOObpDNAladder;Lanel, 8, 15:陽性對照；Lane2-7 :pDown-shP;rmtl-l-eGFP①~⑧克隆；Lane9-14 :pDown-shP;rmtl-2-eGFP①~⑧克隆；Lane16-21 : pDown-shP;rmtl-3-eGFP①~⑧克隆。
[0027] 圖4篩選shRNA干擾PRMT1表達序列?；痷ro2A-shPrmtl-3最大程度抑制PRMT1 表達。
[0028] 圖5慢病毒載體結(jié)構(gòu)圖譜
[0029] 圖6病毒滴度測定稀釋圖。10倍梯度稀釋，稀釋范圍為10 5-10 9
[0030] 圖7驗證慢病毒在伏隔核中表達，卡通示意圖取自小鼠腦圖譜冠狀1. 5mm切片。
[0031]圖8LV-shPRMTl特異性干擾PRMT1 表達。Student'Sttests，*p<0. 05，LV-GFP η= 6,LV-shPRMTln= 6〇
[003引圖9伏隔核內(nèi)注射LV-shPRMT1特異干擾PRMT1蛋白的表達。（A)LV-shPRMT1 干擾伏隔核PRMTl蛋白的表達；度)LV-shPRMTl不影響伏隔核PRMT4蛋白的表達；似LV-shPRMTl不影響伏隔核PRMT5蛋白的表達；Actin作為內(nèi)參蛋白，Student'Sttests, *p<0. 05,LV-GFPn= 4,LV-shPRMTIn= 40
[0033] 圖10伏隔核內(nèi)注射LV-shPRMTl不影響紋狀體PRMT1，PRMT4和PRMT5的表達。（A) LV-shPRMTl不影響紋狀體PRMTl蛋白的表達；度)LV-shPRMTl不影響紋狀體PRMT4蛋白的 表達；(C)LV-shPRMTl不影響紋狀體PRMT5蛋白的表達；Actin作為內(nèi)參蛋白，LV-GFPη= 4,LV-shPRMTIn= 4〇
[0034] 圖11伏隔核內(nèi)注射LV-shPRMTl明顯改善可卡因誘導行為可塑。（A)伏隔核內(nèi)注射 LV-shPRMTl抑制可卡因誘導的獎賞行為，One-wayAN0VA，*i)<0. 05, **p<0. 01，***p<0. 001，LV-GFPSalineη= 13,LV-shPRMTlSalineη= 13,LV-GFPCocaineη= 11， LV-shPRMTlCocainen= 12。度）伏隔核內(nèi)注射LV-shPRMTl減弱可卡因誘導的 自發(fā)活動行為，Two-wayAN0VAanalysisfollowedbybonferronipost-tests, *p<0.05, **p<0. 01and***p<0. 001，LV-GFPSalinen= 11，LV-shPRMTlSalinen= 12， LV-GFPCocainen= 12,n= 13LV-shPRMTlCocaine。
[0035] 圖12PRMTl調(diào)控可卡因獎賞行為與低表達PRMTl相關(guān)。（A)PRMTl調(diào)控可卡因獎賞 行為與低表達PRMTlmRNA相關(guān)，One-way AN0VA，卸<0. 05, **p<0. 01，η= 6/ 組。度)PRMT1 調(diào)控可卡因獎賞行為與低表達PRMTl蛋白相關(guān)，化e-way AN0VA，卸<0. 05，**卸<0. 001，η= 3/組。
[0036]圖 13PRMTl調(diào)控H4R3me2a和a地3Κ9/Κ14 的修飾。（Α)低表達PRMTl降低H4R3me2a 的修飾，One-wayAN0VA，*pi<0. 05，**p<0. 01，n.S.表示沒有統(tǒng)計學差異，η= 4/組。度）低 表達PRMTl通過控制H4R3me2a的修飾影響a地3Κ9/Κ14的表達，One-wayAN0VA，卸<0. 05， η.S.表示沒有統(tǒng)計學差異，η= 4/組。
[0037] 圖14H4R3me2a和a地3Κ9/Κ14調(diào)控(Mk5基因轉(zhuǎn)錄。（Α)在可卡因重復給藥模型 中，H4R3me2a和a地3K9/K14在(Mk5基因啟動子位點結(jié)合增加，S化dents't-test，卸<0. 05， N= 3/組，4只動物伏隔核樣本并入一個樣本（視為N= 1);度）可卡因重復給藥上調(diào)伏隔 核（MkSmRNA的表達，Sl:udents't-test，*p<0. 05,η= 5/ 組。
[0038] 圖15H4R3me2a和a地3Κ9/Κ14調(diào)控CaMKII基因轉(zhuǎn)錄。（A)在可卡因重復給藥模 型中，H4R3me2a和a地3K9/K14在CaMKII基因啟動子位點結(jié)合增加，SUidents't-test， *p<0. 05, N= 3/組，4只動物伏隔核樣本并入一個樣本（視為N= 1);度）可卡因重復給藥 上調(diào)伏隔核CaMKIImRNA的表達，SUidents't-test，*p<0. 05, η=5/組。
[0039] 圖16可卡因重復給藥增高H4R3me2a的表達?？煽ㄒ蛑貜徒o藥增加伏隔核 H4R3me2a的表達，增高H4R3me2a的表達狀態(tài)至少維持到可卡因戒斷后第7天。伏隔核樣本 檢測時間分別為可卡因戒斷1天值1)、7天值7)、14天值14)、28天值28)和42天值42)， Actin作為內(nèi)參蛋白，卸<0. 05表明與生理鹽水組相比較有統(tǒng)計學差異，η= 3/組。
[0040] 圖17可卡因重復給藥降低伏隔核冊腳me2的表達。降低冊腳me2的表達在可卡因 戒斷第7天即恢復正常水平。伏隔核樣本檢測時間分別為可卡因戒斷1天值1)、7天值7)、 14天值14)、28天值28)和42天值42)，Actin作為蛋白內(nèi)參，卸<0. 05表明與生理鹽水組 相比較有統(tǒng)計學差異，η= 3/組。
[0041] 圖18可卡因重復給藥降低伏隔核冊K36me3的表達。降低冊K36me3表達在可卡因 戒斷第7天即恢復正常水平。伏隔核樣本檢測時間分別為可卡因戒斷1天值1)、7天值7)、 14天值14)、28天值28)和42天值42)，Actin作為蛋白內(nèi)參，卸<0. 05表明與生理鹽水組 相比較有統(tǒng)計學差異，η= 3/組。
【具體實施方式】
[0042] 實施例1本發(fā)明干擾PRMTl表達慢病毒的構(gòu)建
[004引 1設(shè)計序列
[0044] 根據(jù)祀基因PRMTl設(shè)計并合成shRNAoligo,oligo序列如下表：
[0045]shRNAPRMTloligo序列
[0046]
[0047] 2構(gòu)建載體
[0048] 2.lOligoDNA的退火
[0049] 把待退火DNAoligo用DEPC處理的水配制成50μΜ，溶解退火緩沖液巧X)， 混勻備