%水合氯醒（0.4g/kg體重）麻醉小鼠，頭頂部剌毛，將麻醉后的小鼠固定在 腦立體定位儀上，調節(jié)頭部至水平狀態(tài)，醫(yī)用酒精消毒皮膚，手術暴露煩骨，用棉球和眼 科剪刀除去煩骨表面的腦膜，找到前因部位，記號筆標記；調節(jié)立體定位儀，按照定位坐 標（AP+1. 6 ;ML±1. 5 ;DV-3. 4)，利用33型注射針，W0. 1μ1/min速率雙側伏隔核內注射 0. 5μ1慢病毒，注射完畢后，緩慢移出注射針，縫合頭頂部皮膚。手術結束后，保溫小鼠至蘇 醒，然后放入干凈飼養(yǎng)籠中，單只單籠飼養(yǎng)。從手術后第二天開始，每天后腿部肌肉注射青 霉素鋼溶液（160000U/ml，0. 1ml/只小鼠），連續(xù)注射3天，小鼠的術后恢復期為7天。經(jīng)過 此手術的動物用于研究伏隔核注射抑制PRMT1表達慢病毒調控可卡因條件性位置偏愛行 為學檢測和自發(fā)活動行為學檢測。
[0098] 3. 5可卡因誘導小鼠條件位置偏愛模型（CP巧
[0099]CPP小鼠可卡因成癒模型建立參考文獻方法學后稍作修改02^，CPP操作如圖1所 示。CPP試驗箱由有機玻璃做成的黑、白兩個大箱和中間一個灰箱構成，一個箱子具有黑 色四壁和具有圓孔的粗糖地面，另一個白色四壁和條紋型的粗超地面。小鼠在實驗箱內自 由活動，適應Ξ天。CPP實驗分為3個階段，在實驗過程中，按照表1-4注射可卡因和生理 鹽水。第一階段（dayl):測試小鼠的自然偏好，在一般條件下，小鼠對黑箱表現(xiàn)出天然的 偏好，所W后面的訓練階段W白箱為伴藥箱。第二階段（day2-day7):為訓練階段，在此期 間，用隔板封閉箱間的通道，第2, 4, 6天注射可卡因，并立即將小鼠放入白箱中，第3, 5, 7天 注射生理鹽水，并立即將小鼠放入黑箱中，每次小鼠在箱內停留的時間為15min;第Ξ階段 (days):為測試階段，在此階段，將箱間的隔板去除，讓小鼠在箱內自由活動，并記錄15min 小鼠分別在黑、白箱內停留時間。小鼠測試結束后，于30min內快速解剖，取出伏隔核用于 后續(xù)檢測。
[0100] 結果用條件性位置偏愛測試期間，條件誘導箱體停留時間減去另外一個箱體停留 時間差值作為誘導后偏好，與自然偏好時間相比較來表達。采用SPSS統(tǒng)計軟件分析實驗結 果，差值W均數(shù)+標準差表示，用t檢驗分析法比較可卡因給藥組和生理鹽水對照組的差 異，p<0. 05為有統(tǒng)計學差異。
[0101] 注意事項：每次動物訓練時，應該輕拿輕放，不要對動物的情緒造成重大影響；每 次訓練結束應該對箱體進行擦拭，W消除每個動物的氣味。光照強度，每天的訓練時間，訓 練時長，噪音應該注意控制。
[0102] 表1-4可卡因給藥途徑、給藥劑量、給藥體積匯總表
[0103]
[0104] 3. 6可卡因獎賞行為的消退模型建立
[0105] 可卡因條件性位置偏愛模型建立后，將生理鹽水組動物隨機分為生理鹽水+溶劑 對照組，生理鹽水+MTA組；將表現(xiàn)出偏愛的可卡因組動物隨機分為可卡因+溶劑對照組，可 卡因+MTA組，所有動物在完成CPP測試后，立即注射相對應的溶劑對照或MTA，然后立即放 入飼養(yǎng)籠，24h后再次測定小鼠對CPP箱的偏愛行為，并記錄15min小鼠分別在黑、白箱內停 留時間。
[0106] 3. 7可卡因自發(fā)活動模型建立
[0107] 實驗前，小鼠適應檢測儀器（圖2)3天，每天5min。實驗開始后，第1天記錄小鼠 的自發(fā)活動值，作為基礎值；W后每天約同一時間腹腔注射20mg/kg可卡因，連續(xù)6天，每天 1次。藥物注射后立即放入自發(fā)活動箱內，記錄30min內小鼠的行為活動（如活動距離）。 [010引 3. 8構建shRNA-PRMTl慢病毒
[0109] 按照實施例1的方法制備。
[0110] 3. 9蛋白提取與蛋白印跡（Western Blot)
[0111] 3. 9. 1總蛋白的提取與定量
[011引取凍存的組織，根據(jù)組織大小加入RIPA裂解液，對于伏隔核組織，加入100μ1左 右，置于冰上裂解5min，然后超聲10次，2秒/次（置于冰上），目的是破碎組織細胞，充分 溶解釋放蛋白，然后4°C，13,OOOg離屯、15min，取出上清液，放冰上。蛋白定量主要參照BCA 方法，主要步驟為：首先，稀釋BSA至1，0. 5, 0. 4, 0. 3, 0. 2, 0. 1，0. 05,Omg/ml濃度梯度；然 后將提取的蛋白液按照伏隔核（1:10稀釋），紋狀體（1:50稀釋），海馬（1:50稀釋）W及 前額皮質（1:10稀釋）稀釋，BSA和蛋白樣品分別加入10μ1至相應孔內。測定前，在各孔 中加入200μ1考馬斯亮藍G250, 595nm測定吸光度值，BSA標準曲線現(xiàn)行相關性為R2〉0. 99 為合格定量標準，然后計算出對應的蛋白濃度；每個樣本加入5X的蛋白上樣緩沖液（含 β-琉基乙醇），使最終濃度為IX。煮沸樣品5min，分裝，儲存于-20°C。3. 9. 2聚丙締酷胺 凝膠電泳
[0113] 按照表1-5,表1-6聚丙締酷胺制備膠配制10%和15%的分離膠和5%的濃縮膠。 將制備好的膠放入電泳槽中，點樣。根據(jù)每個蛋白在伏隔核中的豐度，調整樣品濃度，每個 樣本槽加入蛋白樣本體積約為18μ1。然后使用80V電壓壓縮蛋白樣本至分離膠界限處時， 將電壓增加至120V，直至目的蛋白完全分離。進行轉膜程序時，將載有目的蛋白的膠放入帶 有"Ξ明治"的轉膜夾中，并將經(jīng)過甲醇活化的PVDF膜蓋在膠上，轉膜電壓設定為100V，轉 膜時間根據(jù)蛋白大小而定。轉膜完成后，用TBST配制的5%的脫脂牛奶封閉，封閉時間為1 小時。將一抗按照需要的比例稀釋，用雜交帶封好，4°C過夜，第二天用TBST洗膜立次，每次 lOmin。根據(jù)一抗源性，按照1:5000稀釋相應的第二抗體，室溫化，結束后用TBST洗膜二 次，每次lOmin，然后用TBS洗膜一次，同樣lOmin。曝光時，按照1:1的比例配制發(fā)光A液 和發(fā)光B液，在暗室中將載有目的蛋白的PVDF條帶置于發(fā)光混合液中反應Imin，將PVDF膜 取出，用濾紙吸干多余發(fā)光液，按照正面朝上的原則，將PVDF膜放入暗盒中，膜正面也膠片 接觸，關閉暗盒，封閉膠片時間取決于蛋白豐度，洗片。
[0114] 數(shù)據(jù)處理：將免疫印跡膠片用Image-Pro Plus 6. 0系統(tǒng)讀取各條帶的灰度值，用 beta-actin條帶灰度值作為內參進行標準化比較。
[0115] 表1-抓estern blot分離膠制備配置
[0116]
[0117]表l-GWestern blot濃縮膠制備配置 [011 引
[0119] 3. 10實時巧光定量PCR
[0120] 3. 10. 1RNA提取
[0121] 對于腦組織，將腦組織放入已有1mlTrizol的1. 5mlEP管中，使用1ml槍頭來回 吹打近100次，使組織細胞盡量裂解。對于細胞培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，加入1mlTrizol，室溫放 置5分鐘后反復吹打細胞，使細胞盡量裂解，將細胞裂解物移入一個1. 5mlEP管。然后對 組織裂解液和細胞裂解液加入200μ1氯仿，振蕩15秒，室溫放置2~3分鐘；4°C，12000邑， 離屯、15min，離屯、后，液體分為Ξ層，RNA存在于最上層的水相中，水相層的體積大約為進行 勻漿時的Trizol體積的60%。將水相層轉移到一個新的EP管（1.5ml)中，注意不要污染 中間層，之前所用的1mlTrizol里加入0. 5ml的異丙醇來沉淀RNA，混勻后室溫解育lOmin或者4°C解育20~30min，4°C，12000g離屯、lOmin，RNA沉淀成膠狀黏附在管底。倒掉上清， 瞬離，吸凈殘留。lmlTrizol至少加入lml75%乙醇洗涂RNA，4°C，10000g，離屯、5min。倒 掉上清，瞬離，吸凈殘留。并開蓋室溫干燥lOmin，注意不要過分干燥。使用20μ1DEPC水 溶解RNA，純化的RNA樣本保存于-80°C。
[0122] 3. 10. 2瓊脂糖凝膠電泳
[0123] 將所用的電泳槽、梳子、制膠板子、錐形瓶、量筒（lOOmlUOOOml)準備好并且洗 凈（自來水、去離子水和milic水），然后裝上millic水用于之后稀釋TAE。稱取適量 瓊脂糖于錐形瓶中，按所需濃度及體積加入IXTAE溶液，可配置25-30ml(1 %膠濃度，即 0. 25-0. 3mg)，在微波爐中融化。待稍冷時，加入5μ1GoldView染料，輕搖勻，避免產生氣 泡。冷卻至約60°C時倒膠（厚度在0. 5cmW內），待完全凝固時，拔出梳子，上樣電泳，電泳 緩沖液應沒過膠板。加樣，加樣緩沖液不應小于IX。電泳電壓（樣品由負極（黑）向正極 (紅）移動）200V7min，樣本跑出點樣孔約l-2cm后，用IMAGELAB對瓊脂糖凝膠成像。
[0124] 3.10.3Realtime PCR反應
[01巧]使用商品化的逆轉錄試劑盒合成cDNA度io-rad)，合成的cDNA保存于-80°C。然 后進行realtime PCR反應，本部分使用到的基因mRNA引物序列如表1-7,將所有cDNA樣 品分別配置反應體系。體系配置如下：2XSYBRgreen mix ΙΟμΙ,ΙΟμΜPCR引物F1μ1， 10μΜPCR引物R1μ1，cDNA樣本1μ1，加水至總體積20μ1，輕彈管底將溶液混合，小屯、 蓋上PCR管蓋，500化pm短暫離屯、，在設置PCR程序前將準備好的PCR板放在冰上。將上述 96-PCR板置于realtime PCR儀上進行PCR反應，反應按照W下程序進行：95°C3min，40個 PCR循環(huán)（95°C，15秒；60°C，45秒（收集巧光））。為了建立PCR產物的溶解曲線，擴增反 應結束后，按從65°C緩慢加熱到95°C。
[0126] 表1-7基因mRNA引物序列列表
[0127]
[012引 3. 10. 4結果與計算
[0129] 各樣品的目的基因和內參分別進行Realtime PCR反應，數(shù)據(jù)采用2法進行分 析。3. 11數(shù)據(jù)統(tǒng)計
[0130] 統(tǒng)計學差異通過IBMSPSSStatistics21統(tǒng)計軟件進行。比較兩個實驗組的統(tǒng) 計學差異，使用Students't檢驗；比較Ξ個及W上的實驗組使用單因素方差分析的ne-way AN0VA)T址巧posthoctest進行，包括CPP行為學數(shù)據(jù)、Westernblot數(shù)據(jù)、mRNA結果 分析。對于自發(fā)活動的結果，采用GraphPadPrism5軟件做雙因素方差分析（two-way ANOVAs)bonfe;r;ronipost-tests。在圖片中所有的結果W均值 ±SEM(*f)<0.05，**p<0. 01， ***!)<0. 001)表示。
[0131] 4 結果
[0132] 4. 1伏隔核內注射LV-shPRMTl特異性抑制PRMT1表達
[0133] 本試驗利用轉基因手段，W慢病毒為載體，伏隔核定位注射shRNA-PRMTl表達慢 病毒，觀察PRMT1是否影響可卡因誘導的獎賞行為。GFP巧光圖片表明（圖7)，慢病毒在解 剖位置上表達于...