淀置于SDS蛋白裂解液中，然后超 聲破碎組織，超聲條件為調(diào)整超聲破碎儀，在不產(chǎn)生泡沫的條件下，15秒/次，50秒間隙，共 10次，整個超聲過程中，樣本置于冰浴上，經(jīng)過超聲得到的DNA片段為20化p-500bp的長度， 4°C1300化pm離屯、lOmin，除去不溶物質(zhì)，收集上清液150μ1，其余的樣本保存于-80°C。取 超聲破碎后的組織樣本50μ1用于H4R3me2a沉淀，50μ1用于a地3K9/K14沉淀，50μ1用 于陰性對照，加入含有2. 5μ1蛋白酶抑制劑的450μ1稀釋緩沖液中，各取5%用于Input 對照。Input對照放置于4°C冰箱中保存，在其他樣本中分別加入20μ1的經(jīng)過重懸浮的 蛋白G磁珠，將樣本放置于4°C冰箱中混懸過夜，第二天，利用磁力架（Millipore)洗涂和 分離磁珠和樣本，按照先后順序洗涂磁珠，500μ1/管低鹽洗涂液，500μ1/管高鹽洗涂液， 500μ1/管LiCl洗涂液和500μ1/管ΤΕ洗涂液，在用ΤΕ洗涂液洗涂磁珠時，盡量吸盡洗涂 液，在磁珠-蛋白-DNA復合物中加入含有1μ1蛋白酶Κ的100μ1化IP洗脫液，置于65°C 水浴過夜，然后95°C水浴中l(wèi)Omin，冷卻樣本至室溫，利用磁力架分離磁珠和上清液，專業(yè) 上清液至另一干凈的1. 5ml的EP管，在各管樣本中加入500μ1的結合實際A，充分混勻，轉 移混合液于離屯、過濾器中，lOOOOg離屯、30秒，棄掉離屯、液，收集沉淀；用洗涂試劑Β洗涂沉 淀，lOOOOg離屯、30秒，棄掉離屯、液，收集沉淀；再次lOOOOg離屯、30秒，棄掉離屯、管，將過濾 器置于另一干凈的收集管中，在濾器膜中直接加入50μ1的洗脫緩沖液C，溶解純化的DNA， lOOOOg離屯、30秒，棄掉濾器，收集液體，并將液體保存于-20°C用于后續(xù)PCR檢測。按照W 下反應體系進行Realtime-PCR檢測，d地2〇 8. 5yl，SYBR-greenmastermix12. 5μ1，0ΝΑ 基因引物F1μ1(表2-6)，DM基因引物R1μ1，純化的DM模板2μ1，總反應體系體積 為25μ1。完成加樣后，輕彈管底將溶液混合，小屯、蓋上PCR管蓋，500化pm短暫離屯、，在設 置PCR程序前將準備好的PCR板放在冰上。將上述96-PCR板置于realtimePCR儀上進行 PCR反應，反應按照W下程序進行：95°C10min，50個PCR循環(huán)（95°C，20秒；60°C，60秒（收 集巧光））。為了建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線，擴增反應結束后，按從65Γ緩慢加熱到95Γ。
[0179] 表2-6基因DNA引物序列
[0180]
[0181] 3. 5. 2ChIP結果與計算
[0182] 1、標準化DNA的量
[0183] ACt[no;rmalized畑1門=(Ct[ChI門-(Ct[I叩ut]-Log2(I叩ut Dilution Factor)))
[0184] Input Dilution Factor = (fraction of the input chromatin saved) ^
[0185]2、要加入陰性對照的Ct值
[018引 Δ ACt[ChIP/NIS] = ACt[normalized證1門-Act[陰性]
[0187] 3、計算特定祀點的IP Fold Enrichment(富集程度）
[018引化Id Enrichment=2( 郵p/響）
[0189] 4、S1和S2的比值計算
[0190] Δ Act[S2-S1] = Act[S2:normalized Chi門-Act[S1:normalized Chi門
[01W] 5、樣品比值=2( &&郵2礎
[0192] 3. 6數(shù)據(jù)統(tǒng)計
[019引統(tǒng)計學差異通過IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計軟件進行。比較兩個實驗組的統(tǒng) 計學差異，使用Students't檢驗；比較Ξ個及W上的實驗組使用單因素方差分析的ne-way AN0VA)T址巧post hoc test進行，包括Western blot數(shù)據(jù)和mRNA結果分析。在圖片中所 有的結果均W均值 ±SEM(*i)<0. 05, **p<0. 01，**卸<0. 001)表示。
[0194] 4結果
[0195] 4. lH4R3me2a和a地3K9/K14調(diào)控（Mk5和CaMK II基因的表達
[0196] 化IP實驗技術用于檢測基因轉錄調(diào)控子在基因啟動子區(qū)的結合情況，根據(jù)基因調(diào) 控子對基因的轉錄調(diào)控方向，研究其是否有調(diào)控作用。本試驗采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術 (化I巧檢測可卡因重復注射給藥24h后伏隔核組織H4R3me2a和a地3K9/K14在(Mk5和 CaMKII基因啟動子區(qū)的富集程度。結果表明，可卡因增加H4R3me2a和a地3K9/K14在(Mk5 基因啟動子區(qū)的結合（圖14A)，提示可卡因可能增強Cdk5基因轉錄活性。利用RT-qPCR技 術檢測伏隔核(Mk5基因的表達，檢測結果顯示：可卡因增加伏隔核(Mk5的表達（圖14B)。 利用同樣的檢測手段和數(shù)據(jù)處理方法研究CaMKII基因，發(fā)現(xiàn)可卡因也增加H4R3me2a和 a地3K9/K14在CaMKII基因啟動子區(qū)結合（圖15A)，并且可卡因重復給藥增加了伏隔核 CaMKII的表達（圖15B)。W上結果表明：H4R3me2a和a地3K9/K14調(diào)控可卡因成癒相關 基因的轉錄。
[0197] 4. 2可卡因重復給藥較長時間維持H4R3me2a的修飾
[0198] 為了評價H4R3me2a在可卡因重復給藥引起的長時修飾作用，構建可卡因戒斷模 型。本試驗采用Westernblot技術檢測可卡因戒斷伏隔核H4R3me2a的表達水平。結果表 明，與生理鹽水組比較，可卡因戒斷1天和戒斷7天，H4R3me2a表達顯著增加；可卡因戒斷 14天時，H4R3me2a雖然表達增加，但沒有統(tǒng)計學差異，已開始恢復到正常水平（圖16)。為 了對比可卡因引起H4R3me2a增高表達維持時間，采用Westernblot方法檢測冊腳me2和 冊K36me3的表達。結果表明，與生理鹽水組比較，可卡因戒斷1天冊腳me2和冊K36me3的 表達降低，可卡因戒斷第7天已恢復正常水平（圖17和圖18)，提示可卡因降低H3K9me2和 冊K36me3的修飾不超過戒斷第7天，明顯少于H4R3me2a高表達維持的時間。
[0199]W上結果表明：可卡因上調(diào)PRMT1表達，增加H4R3me2a的修飾，進而調(diào)控下游祀基 因的轉錄，最終影響可卡因誘導的行為可塑。
[0200] 5 結論
[0201] 藥物成癒是一個進行性腦部疾病，很難根治，即使接受了戒斷治療若干年后，成癒 患者仍然面臨高復吸的風險，意味著成癒引起的動物腦部結構和功能素亂非常穩(wěn)定。因此， 可卡因成癒領域研究的關鍵挑戰(zhàn)之一是尋找在大腦中相對穩(wěn)定的變化，運也是很多研究者 視基因表達的改變是成癒形成的一個重要組成部分的原因之一?，F(xiàn)今，可卡因引起的運種 改變被視為"分子和細胞的記憶"，因為蛋白分子的改變可W引起基因表達的改變，進而影 響神經(jīng)元細胞形態(tài)和功能的變化，運種改變包括基因轉錄的改變、表觀修飾的改變、突觸可 塑性的改變、全細胞可塑性的改變、神經(jīng)形態(tài)的改變、神經(jīng)營養(yǎng)因子平衡機制的改變。幾乎 所有的運些改變都可能與成癒狀態(tài)有關聯(lián)。
[0202] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)H4R3me2a表觀標志正性影響可卡因成癒相關基因(Mk5和CaMKII的 表達，可卡因增加H4R3me2a表達的狀態(tài)維持時間長于冊K9me2和冊K36me3降低表達。運 個結果從一個全新的角度解釋了可卡因成癒產(chǎn)生長時記憶。
[0203] 實驗例1中證明了本發(fā)明本發(fā)明重組慢病毒LV-shPRMTl可W干擾PRMT1的表達， 進而下調(diào)H4R3me2a表達，而本實驗例證明了H4R3me2a會正性影響可卡因成癒相關基因 (Mk5和CaMKII的表達，說明本發(fā)明化合物SKLB-639可W通過抑制可卡因成癒相關基因 (Mk5和CaMKII的表達來治療可卡因成癒。
[0204] 綜上所述，本發(fā)明沈QIDNO. 1和沈QIDNO. 2所示shRNA、包含前述shRNA的重 組質(zhì)?；疞U2G-shPrmtl-3W及包含該重組質(zhì)粒的重組慢病毒LV-shPRMTl可W沉默PRMT1 基因，下調(diào)PRMT1的表達，進而抑制H4R3me2aW及可卡因成癒相關基因(Mk5和CaMKII的 表達，可w制備成為治療可卡因成癒的藥物，臨床應用前景良好。
【主權項】
1. SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。 2. SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列。3.-種重組質(zhì)粒，其特征在于：它包括SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示的核苷酸序 列。4. 根據(jù)權利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于：所述重組質(zhì)粒是重組PLLU2G質(zhì)粒。5. 根據(jù)權利要求4所述的在重組質(zhì)粒，其特征在于：所述重組質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ IDNO. 3 所示。6. -種重組慢病毒，其特征在于：它包含權利要求3~5任意一項所述的重組質(zhì)粒。7. 權利要求3~5任意一項所述的核苷酸序列、重組質(zhì)?；蛑亟M慢病毒在制備PRMT1 抑制劑中的用途。8. 權利要求3~5任意一項所述的核苷酸序列、重組質(zhì)?；蛑亟M慢病毒在制備治療可 卡因成癮的藥物中的用途。9. 根據(jù)權利要求8所述的用途，其特征在于：所述治療可卡因成癮的藥物是降低 H4R3me2a的表達水平的藥物。10. 根據(jù)權利要求9所述的用途，其特征在于：所述藥物是降低Cdk5和CaMKII的表 達水平的藥物。11. 一種治療可卡因成癮的藥物，其特征在于：它是以權利要求1~10任意一項所述 的核苷酸序列、重組質(zhì)?；蛑亟M慢病毒為活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而成的 制劑。12. 根據(jù)權利要求11所述的藥物，其特征在于：所述制劑是注射制劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了SEQ？ID？NO.1和2所示的核苷酸序列，本發(fā)明還公開了包含前述核苷酸序列的重組質(zhì)粒PLLU2G-shPrmt1-3，以及包含該重組質(zhì)粒的重組慢病毒LV-shPRMT1。本發(fā)明SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2所示shRNA、包含前述shRNA的重組質(zhì)粒PLLU2G-shPrmt1-3以及包含該重組質(zhì)粒的重組慢病毒LV-shPRMT1，可以沉默PRMT1基因，下調(diào)PRMT1的表達，進而降低H4R3me2a以及可卡因成癮相關基因Cdk5和CaMK？II的表達，可以制備成為治療可卡因成癮的藥物，臨床應用前景良好。
【IPC分類】C12N15/867, C12N15/63, A61K48/00, A61P25/36, C12N15/113
【公開號】CN105255887
【申請?zhí)枴緾N201510460568
【發(fā)明人】岑小波, 李燕
【申請人】四川大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年7月30日
【公告號】CN105125571A, CN105153042A