伏隔核腦區(qū)。
[0134] 為了驗證shRNA-PRMTl病毒特異性抑制PRMT1，采用RT-qPCR方法檢測PRMT1~ PRMT8轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。結(jié)果表明，LV-shPRMTl只干擾PRMT1基因的表達(dá)，對PRMT家族其 他蛋白沒有影響（圖8)。WPRMTI型PRMT4和PRMTII型PRMT5為代表，利用Western blot方法檢測伏隔核內(nèi)PRMT4和PRMT5的表達(dá)。結(jié)果顯示：LV-shPRMTl抑制PRMT1蛋白 表達(dá)，對PRMT4和PRMT5的表達(dá)沒有影響（圖9)。采用同樣的方法檢測了慢病毒是否干擾 伏隔核相鄰腦區(qū)一一紋狀體中相應(yīng)蛋白的表達(dá)。如圖10所示，LV-shPRMTl不影響紋狀體 PRMTUPRMT4和PRMT5的表達(dá)。W上結(jié)果表明伏隔核定位注射技術(shù)是準(zhǔn)確的和慢病毒表達(dá) 載體構(gòu)建技術(shù)是可靠的。
[0135] 4. 2伏隔核內(nèi)低表達(dá)PRMT1調(diào)控可卡因誘導(dǎo)的獎賞行為
[0136] 伏隔核內(nèi)注射LV-shPRMTl的小鼠經(jīng)過可卡因條件性位置偏愛給藥訓(xùn)練，行為學(xué) 結(jié)果顯示，與LV-GFP生理鹽水組比較，低表達(dá)PRMT1明顯改善可卡因誘導(dǎo)的獎賞行為（圖 11A)，也顯著減弱可卡因引起的自發(fā)活動頻率（圖11B)，但LV-shPRMTl生理鹽水不影響小 鼠自身的偏愛行為。為了研究LV-shPRMTl對獎賞行為的影響是否與低表達(dá)PRMT1相關(guān)，本 試驗采用RT-qPCR和Westernblot方法檢測PRMT1的表達(dá)。檢測結(jié)果顯示，與LV-GFP生 理鹽水組比較，LV-shPRMTl生理鹽水組PRMT1在轉(zhuǎn)錄水平（圖12A)和翻譯水平（圖12B) 均被抑制；與LV-GFP可卡因組比較，LV-shPRMTl可卡因組PRMT1表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)差異。 運些結(jié)果表明：伏隔核低表達(dá)PRMT1調(diào)控可卡因誘導(dǎo)的行為可塑。
[0137] 4. 3PRMT1通過調(diào)控H4R3me2a修飾影響可卡因誘導(dǎo)的獎賞行為
[013引為了研究PRMT1調(diào)控可卡因CPP行為的作用機制，本研究利用Westernblot檢測PRMT1修飾底物H4R3me2a的表達(dá)。結(jié)果表明，與LV-GFP生理鹽水組比較，LV-GFP可卡因 組H4R3me2a的表達(dá)明顯增加，但LV-shPRMTl生理鹽水組H4R3me2a的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異 (圖13A);與LV-GFP可卡因組比較，LV-shPRMTl可卡因組H4R3me2a的表達(dá)明顯下調(diào)。
[0139]H4R3me2a的修飾可影響組蛋白冊K9/K14的乙酷化，最終協(xié)同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。為了 了解伏隔核PRMT1調(diào)控H4R3me2a的修飾是否影響H3K9/K14的乙酷化，本試驗進行Western blot檢測。如圖13B所示，與LV-GFP可卡因組比較，LV-shPRMTl可卡因降低ac冊腳/K14 的水平。運些結(jié)果表明：伏隔核低表達(dá)PRMT1降低H4R3me2a和a地3K9/K14的修飾，進而抑 制可卡因誘導(dǎo)的獎賞行為。
[0140] 5 結(jié)論
[0141] 實驗結(jié)果說明，本發(fā)明重組慢病毒LV-shPRMTl可W抑制PRMT1的表達(dá)，進而下調(diào) H4R3me2a的表達(dá)，抑制可卡因誘導(dǎo)的獎賞行為，治療可卡因成癒。
[0142] 實施例2H4R3me2a對成癒相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用
[0143] 1實驗試劑
[0144] 本部分使用的試劑如表2-1。
[0145] 表2-1實驗試劑
[0146]
[0147] 2實驗儀器
[014引本部分使用的儀器如表2-2。
[0149] 表2-2實驗儀器
[0150]
[0151] 3實驗方法
[0152] 3. 1慢性腹腔注射可卡因
[015引給藥方案具體為：同實施例1第3. 2節(jié)，樣本用于化IP、RT-qPCR和Western blot檢測。
[0154] 3. 2可卡因戒斷
[015引 C57小鼠接受20mg/kg可卡因重復(fù)注射，于最后一次注射后，分別于第1天，第7 天，第14天，第28天和第42天取材伏隔核，用于Western blot檢測，即為可卡因戒斷1天 值1)，7天值7)，14天值14)，28天值28)和42天值42)。
[0156] 3. 3蛋白提取與蛋白印跡（Western Blot)
[0157] 3. 3. 1總蛋白的提取與定量
[0158] 取凍存的伏隔核組織，加入100μ1RIPA裂解液，置于冰上裂解5min，超聲10次， 2秒/次（置于冰上），目的是破碎組織細(xì)胞，充分溶解釋放蛋白，然后4°C，13,OOOg離屯、 15min，取出上清液，放冰上。蛋白定量主要參照BCA方法，主要步驟為：首先，稀釋BSA至 1，0. 5, 0. 4, 0. 3, 0. 2, 0. 1，0. 05,Omg/ml濃度梯度；然后將提取的蛋白液按照伏隔核（1:10 稀釋），紋狀體（1:50稀釋），海馬（1:50稀釋）W及前額皮質(zhì)（1:10稀釋）稀釋，BSA和蛋 白樣品分別加入10μ1至相應(yīng)孔內(nèi)。測定前，在各孔中加入200μ1考馬斯亮藍(lán)G250, 595nm 測定吸光度值，BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線現(xiàn)行相關(guān)性為r2〉0. 99為合格定量標(biāo)準(zhǔn)，然后計算出對應(yīng)的蛋 白濃度；每個樣本加入5X的蛋白上樣緩沖液（含β-琉基乙醇），使最終濃度為IX。煮沸 樣品5min，分裝，儲存于-20°C備用。
[0159] 3. 3. 2聚丙締酷胺凝膠電泳
[0160] 按照表2-3,表2-4聚丙締酷胺制備膠配制10%和15%的分離膠和5%濃縮膠。將 制備好的膠放入電泳槽中，點樣。根據(jù)每個蛋白在伏隔核中的豐度，調(diào)整樣品濃度，每個樣 本槽加入蛋白樣本體積約為18μ1。然后使用80V電壓壓縮蛋白樣本至分離膠界限處時，將 電壓增加至120V，直至目的蛋白完全分離。進行轉(zhuǎn)膜程序時，將載有目的蛋白的膠放入帶 有"Ξ明治"的轉(zhuǎn)膜夾中，并將經(jīng)過甲醇活化的PVDF膜蓋在膠上，轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)定為100V，轉(zhuǎn) 膜時間根據(jù)蛋白大小而定。轉(zhuǎn)膜完成后，用TBST配制的5%的脫脂牛奶封閉，封閉時間為1 小時。接下來，將一抗按照需要的比例稀釋，用雜交帶封好，4Γ過夜，第二天用TBST洗膜Ξ 次，每次lOmin。根據(jù)一抗源性，按照1:5000稀釋相應(yīng)的第二抗體，室溫化，結(jié)束后用TBST 洗膜二次，每次lOmin，然后用TBS洗膜一次，同樣lOmin。曝光時，按照1:1的比例配制發(fā) 光A液和發(fā)光B液，在暗室中將載有目的蛋白的PVDF條帶置于發(fā)光混合液中反應(yīng)Imin，將 PVDF膜取出，用濾紙吸干多余發(fā)光液，按照正面朝上的原則，將PVDF膜放入暗盒中，膜正面 也膠片接觸，關(guān)閉暗盒，封閉膠片時間取決于蛋白豐度，洗片。
[016。 數(shù)據(jù)處理：將免疫印跡膠片用Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)讀取各條帶的灰度值，用 內(nèi)參蛋白條帶灰度值進行標(biāo)準(zhǔn)化比較。
[0162] 表2-3Weste;rn blot分離膠制備配置
[0163]
[0164] 表2-4Weste;rn blot濃縮膠制備配置
[0165]
[0166] 3. 4實時巧光定量PCR
[0167] 3. 3. 1RNA提取
[0168] 將腦組織轉(zhuǎn)移入已有1mlTrizol的1. 5mlEP管中，使用1ml槍頭來回吹打近 100次，使組織細(xì)胞盡量裂解。對于細(xì)胞培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，加入1mlTrizol，室溫放置5分 鐘后反復(fù)吹打細(xì)胞，使細(xì)胞盡量裂解，將細(xì)胞裂解物移入一個1.5mlEP管。然后對組織裂 解液和細(xì)胞裂解液加入200μ1氯仿，振蕩15秒，室溫放置2~3分鐘；4°C，12000g，離屯、 15min，離屯、后，液體分為Ξ層，RNA存在于最上層的水相中，水相層的體積大約為進行勻漿 時的化izol體積的60%。將水相層轉(zhuǎn)移到一個新的EP管（1.5ml)中，注意不要污染中間 層，之前所用的1mlTrizol里加入0. 5ml的異丙醇來沉淀RNA，混勻后室溫解育lOmin或 者4°C解育20~30min，4°C，12000g離屯、lOmin，RNA沉淀成膠狀黏附在管底。倒掉上清， 瞬離，吸凈殘留。lmlTrizol至少加入lml75%乙醇洗涂RNA，4°C，10000g，離屯、5min。倒 掉上清，瞬離，吸凈殘留。并開蓋室溫干燥lOmin，注意不要過分干燥。使用20μ1DEPC水 溶解RNA，純化的RNA樣本保存于-80°C。
[0169] 3. 3. 2瓊脂糖凝膠電泳
[0170] 將所用的電泳槽、梳子、制膠板子、錐形瓶、量筒（lOOmlUOOOml)準(zhǔn)備好并且洗 凈（自來水、去離子水和milic水），然后裝上millic水用于之后稀釋TAE。稱取適量 瓊脂糖于錐形瓶中，按所需濃度及體積加入IXTAE溶液，可配置25-30ml(1 %膠濃度，即 0.25-0. 3mg)，在微波爐中融化。待稍冷時，加入5μ1GoldView染料，輕搖勻，避免產(chǎn)生 氣泡。冷卻至約60°C時倒膠（厚度在0. 5cmW內(nèi)），待完全凝固時，拔出梳子，上樣電泳，電 泳緩沖液應(yīng)沒過膠板。加樣，加樣緩沖液不應(yīng)小于IX。電泳電壓（樣品由負(fù)極（黑）向正 極（紅）移動）200V7min，樣本跑出點樣孔約l-2cm后，用IMAGELAB對瓊脂糖凝膠成像。 3. 3. 3RealtimePCR反應(yīng)
[017。 使用商品化的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA度io-rad)，合成的cDNA保存于-80°C。然 后進行realtimePCR反應(yīng)，本部分使用到的基因mRNA引物序列如表2-5,將所有cDNA樣 品分別配置反應(yīng)體系。體系配置如下：2XSYBRgreenmixΙΟμΙ,ΙΟμΜPCR引物F1μ1， 10μΜPCR引物R1μ1，cDNA樣本1μ1，加水至總體積20μ1，輕彈管底將溶液混合，小屯、 蓋上PCR管蓋，500化pm短暫離屯、，在設(shè)置PCR程序前將準(zhǔn)備好的PCR板放在冰上。將上述 96-PCR板置于realtimePCR儀上進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)按照W下程序進行：95°C3min，40個 PCR循環(huán)（95°C，15秒；60°C，45秒（收集巧光））。為了建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線，擴增反 應(yīng)結(jié)束后，按從65°C緩慢加熱到95°C。
[0172] 表2-5基因mRNA引物序列
[0173]
[0174] 3. 3. 4結(jié)果與計算
[0175] 各樣品的目的基因和內(nèi)參分別進行Realtime PCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)采用2 法進行分 析。
[0176] 3. 5染色質(zhì)免疫共沉淀（化IP)
[0177] 3. 5.IChlP操作方法
[0178] 具體操作步驟為：解剖取材前幾分鐘配制含有ImMPMSF蛋白酶抑制劑的PBS液， 將新鮮的伏隔核組織放入500ml的PBS(lmMPMS巧溶液中，4只小鼠伏隔核組織混在一起 作為一個組織樣本，用200μ1槍頭反復(fù)吹打組織，破碎組織至細(xì)微顆粒，然后離屯、，收集組 織沉淀。利用37%甲醒交聯(lián)15min，2Μ甘氨酸終止反應(yīng)（終濃度為0. 125Μ)，使用預(yù)冷PBS 洗涂交聯(lián)沉淀3次，每次5min，離屯、，最后收集沉淀，將沉