用。設(shè)置反應(yīng)體系如下：DEPC-water40μ1 ;退火緩沖液巧Χ)20μ1;DNA olig〇-F(50yM)20yl;DNAolig〇-R(50yM)20yl;總反應(yīng)體系為100μΙ。按照上述反應(yīng) 體系依次加入各種試劑，混勻。然后設(shè)置PCR儀進行退火反應(yīng)如下：95°C2min;每8s下降 0.rc，降至25°C約90min;4°C長時間保存。最后，-20°C冰箱保存。
[0050] 2. 2酶切載體化LU2G
[0051]酶切體系設(shè)置如下：PLLU2G巧 15ng/yl)3yl;10ΧΚbuffer5μ1 ;化〇1 1μ1 化al1μ1化040μ1;總反應(yīng)體積為50μ1。反應(yīng)條件為在37°C酶切3個小時，然后用 exioadingbuffer終止反應(yīng)，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳并切膠回收。DNA瓊脂糖凝膠 電泳回收參照天根的DNA瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒進行回收，并測濃度（ng/μ1)。
[0052] 2. 3連接化LU2G與shRNA片段
[005引連接體系設(shè)置如下：化LU2G酶切回收產(chǎn)物（160ng) (160/Con)μ1 ;退火的Oligo DNA(l/l0稀釋 1μ1;10ΧΤ40ΝΑligasebuffer2. 5μ1;Τ40ΝΑligase1μ1;加 &0至。 25μ1 ;總反應(yīng)體系體積為25μ1，然后16°C連接過夜。
[0054] 2. 4轉(zhuǎn)化S憂13細菌
[00巧]把 10μ1 連接反應(yīng)物加入到 100μLSTBL3QiemicallyCompetentE.coli中，冰上解育30分鐘；42 °C熱擊細胞30秒；立即轉(zhuǎn)移到冰上解育2分鐘；加入250μ1 S. 0.C.medium,在37°C、225RPM.的搖床里解育1小時；把100μ1轉(zhuǎn)化物涂到含有100μg/ 血Amp的LB平板上，37°C解育過夜。
[0056] 2. 5PCR篩選陽性重組子
[0057]PCR鑒定引物：PLLU2G-flank-f:AGGCTTAATGTGCGATAAAAGAC，化LU2G-flank-r: GAGCTTATCGATACCGTCGAC;按照下列PCR反應(yīng)體系：滅菌水 16. 1μ1 ;10XTaqBuffer with(NH4)2S043yl;dNTPMixture(10yM)3yl;MgC122yl;引物-Ρ(10μΜ)1.2μ1 ;引 物-R(10μΜ) 1μ1 1. 2μ1;TaqDNApolymerase1. 5μ1 ;模板DNA2μ1 ;總反應(yīng)體積為 30μ1。PCR擴增程序：94°C3min;94°C，30S;60°C，30S;72°C，lmin(21A/min) ;29 個循環(huán) 72°CImin。
[0058] 2. 6挑取陽性克隆質(zhì)粒W及送交陽性克隆測序鑒定
[0059] 送交陽性克隆測序鑒定的測序引物為：shRNA-F:TGATAGGCTTGGATTTCT， 化LU2G-R:GCGCCCTTCGTCTGACGTG。菌落PCR鑒定結(jié)果如圖 3。利用Westernblot對 3 個序列體外干擾PRMT1表達檢測，結(jié)果顯示，化LU2G-shPRMTl-3(含有shPrmtl-1-F和 shPrmtl-l-R的重組質(zhì)粒）對PRMT1抑制效果最好（圖4)，故后續(xù)病毒包裝中選用該發(fā)卡 序列作為目的序列。圖5所示為載體結(jié)構(gòu)圖譜。
[0060]化LU2G-shPRMTl-3 的全序列（SEQIDNO. 3):
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] 序列說明：
[0065] 下劃線的序列為插入到化LU2G載體的第一條shPrmtl-l化i巧in sequence,其余 兩條干擾載體的全序列可用其對應(yīng)的化irpin sequence替換紅色標(biāo)識的序列而得。
[0066]化LU2G-control全序列如沈Q ID NO. 4所示。
[0067] 3病毒包裝及滴度測定
[0068] 3. 1病毒包裝
[0069] 取細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293FT細胞，細胞計數(shù)后，按照每個10cm的培 養(yǎng)皿5X106個細胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中，37°C，5%C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；第二天轉(zhuǎn)染前 去除舊的培養(yǎng)液，加入5mL新鮮的含10%血清DMEM培養(yǎng)液；制備DNA-Lipofectamine2000 復(fù)合物，W-個10cm培養(yǎng)皿的用量為示范：準(zhǔn)備一支無菌的5mL離屯、管，先加入1. 5mL無 血清Opi」-MEM別培養(yǎng)液，再加入pLV/helper-化3、pLV/helper-化4、pLV/helper-化5、目 的質(zhì)粒（各4μg)，輕輕顛倒混勻；準(zhǔn)備另外一支無菌的5mL離屯、管里，加入1. 5mL無血清 Opti-MEM及I培養(yǎng)液和40μL的Lipofectamine2000,輕輕顛倒混勻。室溫解育5分鐘； 5分鐘后，將已稀釋DNA加入到含有Lipofectamine2000的無血清飾ii-MEM剎培養(yǎng)液， 輕輕顛倒混勻。室溫解育20分鐘；將DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物一滴一滴地添加到 293FT細胞中，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿W混勻復(fù)合物。放置37°C、5%C〇2飽和濕度培養(yǎng)箱 中過夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后一天，更換10血含10%血清DMEM培養(yǎng)液。放置37°C、5%C〇2飽和濕 度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后48小時收集培養(yǎng)上清進行濃縮；加入10ml新鮮的培養(yǎng)液繼 續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后72小時再次收集濃縮；收集濃縮條件為：300化pm低速離屯、15min，上清用 0. 45μm濾器進行過濾，W徹底去除細胞碎片；每個UT離屯、管裝20血濾液，4°C50000Xg 高速離屯、90min沉淀病毒顆粒，棄去上清，用少量皿SS重懸；在UT離屯、管裝lOmL預(yù)冷的 20%薦糖溶液（皿SS溶解），將重懸溶解好的病毒液小屯、加到薦糖頁面上，20°C50000Xg高 速離屯、120min沉淀病毒顆粒；棄去離屯、上清，用皿SS重懸病毒沉淀，即得本發(fā)明重組慢病 毒LV-shPRMTl，分裝進入0. 5ml進口AXYGEN管中，每管lOOul。分裝好的病毒放置-80°C保 存。
[0070] 3. 2滴度測定
[0071] 宿主細胞的準(zhǔn)備：轉(zhuǎn)導(dǎo)前一天（第1天），膜酶消化細胞并計數(shù)細胞密度，按照 合適的細胞密度接種到6孔板中（一個樣品準(zhǔn)備兩塊細胞），能使轉(zhuǎn)染當(dāng)天的融合度達到 30%-50%。放置37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。病毒轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天（第2天）， 融解病毒，準(zhǔn)備10倍稀釋系列樣品，稀釋倍數(shù)從10 5到10 9。對于每一個稀釋樣品，用完全 培養(yǎng)液稀釋病毒至總體積1ml。在含有病毒的培養(yǎng)液中加入聚凝胺（工作濃度是6μg/ml， 1ml稀釋病毒液中加入1μ1聚凝胺），W促進病毒感染細胞。輕輕吹打充分混勻。去除細 胞中的培養(yǎng)液，加入已含有不同病毒量的完全培養(yǎng)液。另外，保留一孔不添加病毒的細胞， 作為空白對照組，每孔加入的培養(yǎng)液的體積應(yīng)為1ml(如圖6)。放置37°C、5%C〇2飽和濕 度培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后一天（第3天），去除含有病毒的培養(yǎng)液，加入2mL新鮮的完全 培養(yǎng)液。放置37°C、5%C〇2飽和濕度培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；接種病毒2~3天后計數(shù)巧光克隆 數(shù)目，并計算病毒滴度，PLLU2G-shPrmtl-3病毒（即含有化LU2G-shPrmtl-3重組質(zhì)粒的慢 病毒一一LV-shPRMTl)滴度結(jié)果見下表a,對照組滴度結(jié)果見下表b。
[0072]表aPliiJ2G-shPrmtl-3病毒（LV-shPRMTl)滴度結(jié)果
[0073]
[0074]表b化LU2G-control病毒滴度結(jié)果
[00 巧]
[0076] 本發(fā)明構(gòu)建得到了包含沈QIDNO. 1和沈QIDNO. 2所示shRNA的重組 質(zhì)?；疞U2G-shPrmtl-3,其可W有效干擾PRMTl表達，本發(fā)明還構(gòu)建得到了含有 化LU2G-shPrmtl-3重組質(zhì)粒的重組慢病毒（LV-shPRMTl)。
[0077] W下用實驗例的方式驗證本發(fā)明的有益效果：
[0078] 實施例1本發(fā)明重組慢病毒LV-shPRMTl治療可卡因成癒
[007引 1實驗試劑
[0080] 本部分使用的試劑如表1-1。
[00引]表1-1實驗試劑
[0082]
[008引2主要儀器
[0084] 本部分使用的實驗儀器如表1-2。
[00財表1-2實驗儀器
[0086]
[0087] 3實驗方法
[008引3. 1實驗動物
[0089] 雄性SPF級健康性成熟（8-12周齡）C57化/6J小鼠由上海市斯萊克實驗動物有限 責(zé)任公司提供，體重20-22g，未交配過。飼養(yǎng)條件：國家成都新藥臨床前安全性評價中屯、普 通動物房，溫度20-25 °C，相對濕度55-65 %，整個實驗過程中，動物自有攝食和飲水，飼養(yǎng) 環(huán)境符合國標(biāo)GB14925-2001。本課題所有的動物實驗操作均符合AAALAC要求，實驗前正常 飼養(yǎng)實驗動物一段時間W熟悉并適應(yīng)環(huán)境。
[0090] 3. 2腦內(nèi)注射PRMT1抑制劑
[0091] 經(jīng)過單側(cè)伏隔核埋管的小鼠，采用33型微量注射針和微量注射導(dǎo)管，按照表1-3 給藥劑量給予不同的PRMT1抑制劑--MTA，AMI-1和SKLB-639。MTA，AMI-1和SKLB-639 用DMS0配制為100X的儲備液，使用前用生理鹽水稀釋至可用濃度。
[0092] 表1-3PRMT1抑制劑注射劑量
[0093]
[0094] 3. 3伏隔核腦區(qū)埋管
[0095] 腦區(qū)定位埋管是腦區(qū)定位給藥的直接手段和常用技術(shù)。本研究中使用10%水合氯 醒（0.4g/kg體重）麻醉小鼠，頭頂部剌毛，將麻醉后的小鼠固定在腦立體定位儀上，固定 后調(diào)節(jié)頭部至水平狀態(tài)，醫(yī)用酒精消毒皮膚，手術(shù)暴露煩骨，用棉球和眼科剪刀除去煩骨表 面的腦膜，找到前因部位，記號筆標(biāo)記；調(diào)節(jié)立體定位儀，安置注射導(dǎo)管（深圳瑞沃德生物 科技有限公司，#62003, 0D0.48mmXID0.34mm)，于前因點調(diào)零；W前因部位為原點，參考 定位坐標(biāo)（伏隔核：AP+1. 6 ;ML+1. 5)把注射針移動到注射部位的正上方，使注射針與煩骨 剛接觸，調(diào)零Y坐標(biāo)，向下緩慢移動注射針至3. 4mm深，松開坐標(biāo)臂并移開，將牙科粉與稀釋 液調(diào)至漿糊狀固定套管下部，與煩骨相連達到固定導(dǎo)管的目的。插入導(dǎo)管帽（深圳瑞沃德 生物科技有限公司，#62102, 0D0.30mm)，防止導(dǎo)管堵塞，縫合頭頂部傷口。手術(shù)結(jié)束后，將 小鼠保溫至蘇醒，然后放入干凈飼養(yǎng)籠中，單只單籠飼養(yǎng)。從手術(shù)后第二天開始，每天后腿 部肌肉注射青霉素鋼溶液（160000U/ml，0. 1ml/只小鼠），并隔天松動導(dǎo)管帽，確保導(dǎo)管通 楊，小鼠的術(shù)后恢復(fù)期為7天。經(jīng)過此手術(shù)的動物用于研究伏隔核注射PRMT1抑制劑（包 括MTA，AMI-1和SKLB-639)調(diào)控可卡因條件性位置偏愛行為檢測。
[0096] 3. 4伏隔核定位注射慢病毒
[0097] 10