一種賴氨酸單甲基化衍生化修飾的抗體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本領域涉及抗原設計、抗原制備以及利用抗原產(chǎn)生抗體的領域，具體而言，本發(fā)明 涉及人工合成的一種新型的修飾性單甲基化賴氨酸以及修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多 肽，以及利用用該修飾性單甲基化賴氨酸，以及修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽作為抗 原產(chǎn)生一種全新的抗體，該抗體可用于識別與富集賴氨酸單甲基化多肽發(fā)生體外衍生化后 的修飾性多肽，本發(fā)明還涉及所述抗體的制備方法。
【背景技術】
[0002] 蛋白或多肽的修飾是生物體內(nèi)自然存在的一種現(xiàn)象，主要是構成多肽或蛋白的氨 基酸的殘基被一些基團修飾，然后調(diào)控生物體內(nèi)一系列生命活動。通常修飾可以是甲基化、 乙?；?、磷酸化修飾等。作為重要的賴氨酸甲基化修飾，修飾的類型分為單甲基化，二甲基 化或三甲基化修飾（ChengX，ZhangX.MutatRes(2007)).。如何有效的檢測體內(nèi)是否存在 甲基化修飾，特別是單甲基化修飾，可以為有效檢測一些重要的疾病提供一種新的方法。因 為，一些自然發(fā)生的甲基化修飾，例如單甲基化修飾異常，會導致一些嚴重疾病的產(chǎn)生，例 如癌癥等。（YutakaKondo等人，MolCellBiol.23(l):206 _ 215(2003)，BerdascoΜ等 人，ProcNatlAcadSci, 106:21830-21835(2009))。
[0003] 賴氨酸甲基化修飾是蛋白質修飾的一種常見方式。通常情況下，蛋白質 修飾的檢測需要有特異性識別該修飾的抗體，如蛋白質賴氨酸乙酰化修飾可由賴 氨酸乙醜化泛抗體識別（1(〇112&1^(168，1'.〇611，128,693 - 705(2007)，136找61'，3· L.Nature，447, 407 - 412 (2007)。賴氨酸甲基化修飾按甲基基團在賴氨酸上的結合形式包 括單甲基化、二甲基化與三甲基化三種形式。相應地，高靈敏度、高特異性賴氨酸單甲基 化、二甲基化與三甲基化抗體的開發(fā)是檢測蛋白質賴氨酸甲基化修飾的前提。（Barski，A. 等人，Celll29, 823 - 837 (2007) ·Rea,S.等人，Nature406, 593 - 599 (2000))。目前，雖然 已有成功開發(fā)的賴氨酸二甲基化與三甲基化抗體用于賴氨酸二甲基化或三甲基化修飾的 檢測，然而并沒有成功開發(fā)的賴氨酸單甲基化修飾的抗體用于賴氨酸單甲基化修飾的檢測 (2191&]11^31^等人，？1'(^6〇1116 3(^611〇6，第6卷，（1)6:2(2008))。由于賴氨酸單甲基化修 飾的基團很小，僅有15Da的分子量，極難產(chǎn)生高的免疫反應，此外單甲基基團的有機屬性 (organic)進一步削弱賴氨酸殘基的免疫原性。這些內(nèi)在的屬性導致直接以賴氨酸單甲基 化基團作為免疫原或賴氨酸單甲基化修飾多肽作為免疫原的抗體開發(fā)存在巨大的困難。
[0004] 因此，有必要開發(fā)一種全新的抗體用于檢測賴氨酸單甲基化修飾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及人工合成的修飾性單甲基化賴氨酸，以及修飾性單甲基化賴氨酸衍生 化多肽，利用修飾性單甲基化賴氨酸，以及修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽作為抗原產(chǎn) 生的抗體可用于識別與富集賴氨酸單甲基化多肽發(fā)生體外衍生化后的修飾性多肽，從而起 到檢測賴氨酸單甲基化修飾多肽與修飾底物的作用。
[0006] -方面，本發(fā)明提供一種修飾性單甲基化賴氨酸，所述修飾性單甲基化賴氨酸具 有如下結構式：
[0007]

[0008] 在一些優(yōu)選的方式中，其中，R為修飾基團，1)R為 其中，R1為烷基（修飾 J 基團碳原子數(shù)小于6個）或者芳香基（修飾基團碳原子數(shù)小于8個）；或者，2)R為磺?；?br>其中R2為烷基（修飾基團碳原子數(shù)小于6個）或者芳香基（修飾基團碳原子數(shù)小 于8個）。優(yōu)先地，R為乙?；?br>更優(yōu)先地，
[0009] 另一方面，本發(fā)明還提供一種修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽。所述修飾性單 甲基化賴氨酸衍生化多肽的序列為CXnGGK*GGXn，其中X為19中常見氨基酸中除半胱氨酸 之外的任意一氨基酸，η為1-20 ;其中，，K*的結構如下：
[0010]
[0011] 在一些優(yōu)選的方式中，其中，R為修飾基團，1)R
其中，R1為烷基（修飾 基團碳原子數(shù)小于6個）或者芳香基（修飾基團碳原子數(shù)小于8個）；或者，2)R為磺?；?br>^其中R2為烷基（修飾基團碳原子數(shù)小于6個）或者芳香基（修飾基團碳原子數(shù)小 于8個）。優(yōu)先地，R為乙?；?br>更優(yōu)先地，
[0012] 優(yōu)先地，該多肽序列為CEGRGDSGGGK*GGSG，其中K*選自甲基丙?；⒓谆阴；?或甲基丁?；揎椥再嚢彼?，在一些優(yōu)選的實施例中，K*為甲基丙?；嚢彼?。
[0013] 又一方面，本發(fā)明提供一種抗原。抗原由上述修飾性單甲基化賴氨酸或者修飾性 單甲基化賴氨酸衍生化多肽與含有活化基團的載體蛋白偶聯(lián)而成，所述載體蛋白包括但不 限于血藍蛋白（KLH)、牛血紅蛋白、牛血清蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)等。
[0014] 優(yōu)先地，與載體蛋白活化基團偶聯(lián)的修飾性單甲基化賴氨酸為丙?；瘑渭谆?氨酸。
[0015] 優(yōu)選的，與載體蛋白活化基團偶聯(lián)的修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽為單甲 基丙?；嚢彼岫嚯模嚯牡男蛄袨镃XnGGK*GGXn，其中X為19中常見氨基酸中除半胱氨 酸之外的任意一氨基酸，η為1-20, ；K*為單甲基丙酰化賴氨酸。優(yōu)先地，該多肽序列為 CEGRGDSGGGK*GGSG，其中Κ*為甲基丙酰化賴氨酸。
[0016] 又一方面，本發(fā)明提供一種抗體。該抗體由上述的抗原免疫動物制備而成。與載體 蛋白活化基團偶聯(lián)的修飾性單甲基化賴氨酸為抗原免疫兔子可制備多克隆抗體，優(yōu)先地， 載體蛋白活化基團與單甲基丙?；嚢彼釣榭乖庖咄米又苽浍@得多克隆抗體。與載體蛋 白活化基團偶聯(lián)的修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽為抗原免疫小鼠可制備單克隆抗體。 與載體蛋白活化基團偶聯(lián)的多肽的序列為CXnGGK*GGXn，其中X為19中常見氨基酸中除半 胱氨酸之外的任意一氨基酸，η為1-20,為氨基酸殘基的數(shù)目；K*為單甲基丙?；嚢彼?。 優(yōu)先地，載體蛋白活化基團偶聯(lián)的多肽序列為CEGRGDSGGGK*GGSG，其中Κ*為甲基丙?；?氨酸。
[0017] 由本發(fā)明提供的抗體能夠特異結合一種多肽，該多肽包括一個或一個以上修飾性 單甲基賴氨酸，其結構如下：
[0018]
[0019] 在一些優(yōu)選的方式中，其中，R為修飾基團，1)R為
其中，R1為烷基（修飾 基團碳原子數(shù)小于6個）或者芳香基（修飾基團碳原子數(shù)小于8個）；或者，2)R為磺?；?br>其中R2為烷基（修飾基團碳原子數(shù)小于6個）或者芳香基（修飾基團碳原子數(shù)小 于8個）。優(yōu)先地，R為乙酰基
更優(yōu)先地，
[0020] 除了免疫動物獲得具備上述特性的抗體外，根據(jù)抗體開發(fā)的原理，該抗體還可以 通過修飾性單甲基賴氨酸或修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽從噬菌體展示庫、酵母展示 庫、細菌展示庫以及核糖體展示庫中篩選制備而成。優(yōu)先地，修飾性單甲基賴氨酸為單甲基 丙?；嚢彼幔揎椥詥渭谆嚢彼嵫苌嚯男蛄袨镃XnGGK*GGXn，其中X為19中常見 氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸，η為1-20,為氨基酸殘基的數(shù)目；K*為單甲基丙 ?；嚢彼?。優(yōu)先地，該多肽序列為CEGRGDSGGGK*GGSG，其中Κ*為甲基丙?；嚢彼帷?br>[0021] 本發(fā)明的有益效果
[0022] 本發(fā)明提供一種人工合成的修飾性單甲基化賴氨酸及修飾性單甲基化賴氨酸衍 生化多肽，利用該修飾性單甲基化賴氨酸及修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽作為抗原， 經(jīng)過免疫動物可制備一種特異性抗體，的抗體可用于識別與富集賴氨酸單甲基化多肽發(fā)生 體外衍生化后的修飾性多肽，從而起到檢測賴氨酸單甲基化修飾多肽與修飾底物的作用。
[0023] 細胞雜交株保藏說明
[0024] 保藏中心名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0. 9109的PMT-001細胞株，分類名：鼠源雜交瘤細胞，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號中國科學院微生物研究所。
【附圖說明】
[0025] 圖1所示為斑點印跡實驗檢測賴氨酸單基丙酰化兔源多克隆抗體特異性。每一斑 點印跡所對應的上樣量為20納克。1 :賴氨酸甲基丙?；嚯膸?；2 :賴氨酸甲基丙?；疓G 多肽；3 :甲基丙?；嚢彼嵝》肿踊衔?；4 :KLH偶聯(lián)的甲基丙?；嚢彼嵝》肿踊衔?； 5 :賴氨酸丙?；嚯膸?；6 :賴氨酸丙酰化GG多肽；7 :賴氨酸甲基乙?；嚯膸?；8 :賴氨酸 甲基乙?；疓G多肽；9 :賴氨酸甲基丁?；嚯膸欤?0 :賴氨酸甲基丁?；疓G多肽；11 :未 修飾的賴氨酸多肽庫；12 :未修飾的賴氨酸GG多肽；13 :KLH。
[0026] 圖2所示為斑點印跡實驗檢測賴氨酸甲基丙?；迷炊嗫寺】贵w特異性。每一斑 點印跡所對應的上樣量如圖左標記所示。1 :賴氨酸甲基丙酰化多肽庫；2 :賴氨酸丙酰化多 肽庫；3 :賴氨酸丁酰化多肽庫；4 :賴氨酸單甲基化多肽庫；5 :賴氨酸二甲基化多肽庫；6 : 賴氨酸三甲基化多肽庫。
[0027] 圖3所示為競爭ELISA實驗檢測賴氨酸甲基丙?；迷炊嗫寺】贵w特異性。實驗 中所用多肽序列見表1及表2。
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