特異性識別賴氨酸甲基丙?；嚯膸臁①嚢彼峒谆；疓G多肽、單 甲基化丙?；嚢彼嵝》肿蛹癒LH偶聯(lián)的單甲基化丙?；嚢彼嵝》肿?，但并不識別其他 類型賴氨酸修飾的多肽（圖1)，由此說明了抗體良好的特異性。圖2的結(jié)果表明，所開發(fā)的 單甲基化丙?；嚢彼岫嗫寺】贵w能夠識別4納克的賴氨酸甲基丙酰化多肽庫，但不識別 結(jié)構(gòu)類似的直至100納克其他修飾性賴氨酸多肽庫，這既表明所開發(fā)抗體的靈敏度，也進 一步表明了該多克隆抗體的特異性。
[0108] 6、ELISA檢測：
[0109] 1)包被：用去離子水稀釋賴氨酸甲基丙?；嚯闹?X10 3mg/mL，50μ1/孔，4°C包 被酶標(biāo)板過夜；
[0110] 2)封閉：第二天用TBST洗 1 次，5 分鐘 / 次，200μ1/孔，拍干，1%BSA/TBS70y1 封閉45分鐘；
[0111] 3)競爭：純化的賴氨酸單甲基化丙?；嗫寺】贵w用PBS1:200稀釋，隨后分別加 入0納克，10納克，50納克和100納克表1及表2中所列舉多肽，4°C反應(yīng)過夜；
[0112] 4)加入純化的賴氨酸單甲基化丙?；嗫寺】贵w：第二日，3000g離心取上清，稀 釋10倍，加入到酶標(biāo)板中，50μ1/孔。26°C孵育2小時。
[0113] 5)加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗：TBST洗3次，5分鐘/次，200μ1/孔，拍干，加 入二抗，1:10000 稀釋（1%834八83)，5(^1/孔，261：孵育45分鐘。
[0114] 6)加底物：按步驟5的方法，TBST洗3次，拍干。50μ1/孔加入ΤΜΒ顯色底物， 26 °C反應(yīng)30分鐘；
[0115] 7)終止：加入2M硫酸，50μ1/孔。
[0116] 8)顯色：酶標(biāo)儀0D45。測定吸光度。
[0117] 從圖3的結(jié)果可以看出，逐漸提高與純化抗體相競爭的賴氨酸甲基丙?；嚯?庫、賴氨酸甲基丙?；疓G多肽的量，抗體與預(yù)包被的賴氨酸甲基丙酰化多肽反應(yīng)的ELISA 信號也隨之逐漸降低，而與其他修飾性賴氨酸多肽競爭后抗體則與預(yù)包被的賴氨酸甲基丙 酰化多肽反應(yīng)的ELISA信號基本保持不變，由此進一步說明所開發(fā)的賴氨酸單甲基化丙酰 化多克隆抗體的特異性。
[0118] 實施例2單克降抗體的制各
[0119] 1、抗原多肽序列的確定及以合成
[0120] 用于免疫的多肽序列：CEGRGDSGGGK*GGSG，其中，第i^一位賴氨酸（K)殘基上聯(lián)接 單甲基基團（me)和丙?；╬rop)基團。
[0121] 對照多肽序列（對照序列，不用于免疫）：CEGRGDSGGGKGGSG，第i^一位賴氨酸（K) 殘基無任何基團修飾。
[0122] 抗原多肽合成步驟如下：
[0123] A.丙?；瘑渭谆嚢彼嵩希‵moc-Lys(me-prop)-OH)的合成（即在賴氨酸 ε-殘基上連接單甲基丙?；鶊F））
[0124] 1)氯甲酸芐基-賴氨酸（三氟乙酸，甲基）_甲酯（Z-Lys(TFA，me)-〇me)的制備： 氯甲酸芐基-賴氨酸（三氟乙酸）-〇H(Z-Lys(TFA)-〇H)、碘甲烷（1%1)、1(2〇)3與01^-起反 應(yīng)回流，取反應(yīng)液送質(zhì)譜檢測確定合成成功；
[0125] 2)氯甲酸芐基-賴氨酸（甲基）-〇H(Z-LyS(me)-〇H)的生成：步驟1生成的 Z-Lys(TFA，me) -Ome與LiOH飽和溶液在pH大于12. 0下反應(yīng)，取反應(yīng)液送質(zhì)譜檢測確定合 成成功；
[0126] 3)氯甲酸芐基-賴氨酸（甲基-丙?；?OH(Z-Lys(me-prop) -0H)的生成： Z-LyS(me)-〇H、丙酸酐與三乙胺在pH為9. 0的條件下反應(yīng)，取反應(yīng)液送質(zhì)譜檢測。反應(yīng)完 全，酸化，醋酸乙酯萃取。濃縮成油狀物。
[0127]4)H-Lys(me_prop)-〇H的生成：步驟 3 獲得的Z_Lys(me,prop)-〇H在甲醇中溶解， 加入鈀碳Pd/C，通氫氣，TLC跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)完后，過濾，濾液濃縮得固體，隨后用乙醚洗4 次，烘干。
[0128] 5)Fmoc-Lys(me-prop)-〇H的生成：H-Lys(me-prop)-〇H、荷甲氧羰酰琥拍酰亞胺 (Fmoc-OSu)飽和NaHC03溶液與丙酮在pH為9. 0反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)完全后，常規(guī)處 理，酸化，產(chǎn)品用醋酸乙酯萃取，干燥濃縮至油狀物。
[0129] B.抗原多肽的合成
[0130] 多肽合成在ABI433多肽合成儀上進行。
[0131] 1)樹脂溶脹：N-荷甲氧羰基-甘氨酸王樹脂（Fmoc-Gly-Wangresin)用二氯甲燒 浸泡15分鐘，待樹脂膨脹，抽去二氯甲烷；
[0132] 2)脫除氨基保護：加入體積比為1:4的六氫吡啶/DMF溶液，使用氮氣鼓動，反應(yīng)2 次，時間為5分鐘和15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌樹脂9次。取少量樹脂加入驗色劑ABC 各2-3滴（A液：茚三酮/無水乙醇溶液；B液：吡啶；C液：苯酚/無水乙醇溶液）在100°C 下共熱3分鐘，溶液及樹脂顏色為藍色（有的氨基酸為紫紅色），即可判斷氨基保護已經(jīng)脫 除
[0133]3)縮合反應(yīng)：加入Fmoc-Gly-ΟΗ和1-羥基苯并三唑（Η0ΒΤ)，用適量DMF溶解，加 入DIEA，氮氣鼓動，反應(yīng)1小時，反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌樹脂6次。取少量樹脂驗色，方法同 步驟2,溶液及樹脂顏色應(yīng)為無色，即可認(rèn)定反應(yīng)完成。
[0134] 4)重復(fù)步驟2-3,依次連接預(yù)先按等摩爾比例混合的多肽序列中的氨基酸，直至 序列的完成，將樹脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干
[0135] 5)將多肽從樹脂上切掉：加入TFA，在恒溫?fù)u床中反應(yīng)2小時，搖床轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/ 分鐘，溫度25度。
[0136] 6)析出粗品：濾去樹脂，向濾液中加入無水乙醚，用離心機離心后獲得固體，加入 無水乙醚洗滌，再離心，重復(fù)數(shù)次后烘干即可獲得粗品多肽。
[0137] 2、多肽全抗原制備
[0138] 1)將 20mgKLH溶于 2mL5mMEDTA/H20 中；
[0139] 2) 5mgSμLfo-SMCC完全溶于 40μLDMS0 后，加入 160μLPBS，混合均勻；
[0140] 3)將SμLfo-SMCC溶液逐滴加入KLH溶液中，邊加邊攪拌。室溫放置1小時，接 著將上述活化的KLH溶液在1L4°C預(yù)溫的PBS中4°C透析1小時；換液后，4°C透析2小時， 重復(fù)1次；稱取5mg抗原多肽，溶于100yLDMS0中，再加入400yLPBS，混合均勻，隨后 加入500μL上述透析好的活化KLH溶液，4 °C冰箱過夜；
[0141] 4)上述連接有KLH的抗原多肽的交聯(lián)復(fù)合物于4LPBS溶液中，4°C透析過夜；
[0142] 5)第二日取出KLH-抗原多肽，_20°C儲存。
[0143] 3、動物免疫程序
[0144] 1)6-8周齡Balb/c小鼠，皮下多點注射；
[0145] 2)第一次免疫為100μLlmg/mL免疫原與同體積完全福氏佐劑混合乳化，背部皮 下多點免疫；
[0146] 3)3周后，0. 5mg/mL免疫原100μL與同體積不完全福氏佐劑混合乳化后，背部皮 下多點注射；
[0147] 4)以后每隔2周，按步驟3的劑量與方法加強免疫；
[0148] 5)第4次免疫10天后取20μL血清，用ELISA方法檢測血清滴度。若血清滴度不 合格（血清滴度要大于3萬），則繼續(xù)重復(fù)步驟4直至血清滴度大于3萬。
[0149] 4、細胞融合
[0150] 1)小鼠拉頸處死后，取出脾臟，在鐵絲網(wǎng)上磨碎，收集脾細胞，DMEM培養(yǎng)基清洗兩 遍，計數(shù)；
[0151] 2)將sp2/0骨髓瘤細胞收集到50ml離心管中，離心5分鐘，計數(shù)；
[0152] 3)脾細胞和sp2/0細胞按1:4比例混合吹勻后離心收集；
[0153] 4)將培養(yǎng)基倒干凈，敲打離心管底部，使細胞沉淀松散；
[0154]5)用巴斯德吸管沿離心管壁加入1ml聚乙二醇（PEG)，攪拌60秒，隨后加入30ml 預(yù)熱的培養(yǎng)液。蓋好蓋子，混勻，離心，倒凈培養(yǎng)基；
[0155] 6)加入新鮮HAT培養(yǎng)基重懸細胞鋪入96孔細胞培養(yǎng)板。
[0156] 7)通過ELISA篩選獲得陽性細胞株，進行兩次亞克隆，獲得系列穩(wěn)定的陽性細胞 融合株，例如保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的，保藏號9109的 PMT-001細胞株，該細胞株可以分泌單克隆抗體。
[0157] 5、腹水生產(chǎn)
[0158] 1)亞克隆穩(wěn)定的細胞擴大培養(yǎng)（例如保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心的，保藏號9109的PMT-001細胞株）；
[0159] 2)8周齡以上的Balb/c小鼠腹腔注射0. 5ml不完全佐劑；10天后，待小鼠腹部稍 稍隆起，，每只小鼠免疫1X106細胞；
[0160] 3)7天后收集腹水，12000g離心，去掉脂肪，收集上清。
[0161] 6、腹水純化
[0162] 1) 15毫升腹水12000g離心10分鐘，0. 45μm濾膜過濾；
[0163] 2)將5毫升的ProteinG裝入層析空柱中，用4倍柱體積PBS清洗1次，室溫平衡 30分鐘；
[0164] 3)將步驟1中的腹水15毫升加入