抗體上的一些片段。一個結(jié)合片段或抗 體片段包括，但不局限于，（i)Fab片段，它包括VL，VH，CL和CH1區(qū)域；（ii)Fd片段，它包括 VH和CH1區(qū)域（iii)Fv片段，它包括抗體的一個單鏈上的VL和VH區(qū)域；（iv)dAb區(qū)域（Ward etal.，Nature341:544-546 (1989)，它包括VH區(qū)域；（v) -個獨立的決定簇（CDR) ; (vi) - 個F(ab'）2片段，一個二價片段包括兩個通過二硫化物在鉸鏈區(qū)連接的Fab片段。另外，雖 然這Fv片段上的兩個區(qū)域是不同的基因編碼所決定，人工合成的連接試劑可以讓他們形 成單一的蛋白鏈（已知的單一Fv(scFv)鏈）（Bird等人，Science242:423-426 (1988);和 Huston等人，PNAS85:5879-5883 (1988))。蛋白片段包括那些可以交聯(lián)結(jié)合他們的目標(biāo)抗 原的片段，例如二價片段，如F(ab'）2片段?？蛇x的，那些不能自我交聯(lián)結(jié)合目標(biāo)抗原的蛋 白片段也可與第二抗體一起結(jié)合目標(biāo)抗原。
【具體實施方式】
[0048] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。。
[0049] 本發(fā)明實施例中使用的試劑如下列表：
[0050] 表 1
[0051]
[0052] 本發(fā)明實施例中各種溶液配方如下：
[0053] 表 2
[0054]
[0055] 實施例1多克隆抗體的制備
[0056] 1、單甲基丙酰化賴氨酸小分子的合成（Lys(me-prop)-OH)的合成即在賴氨酸 ε-殘基上連接甲基丙?；鶊F，NHFMoc為保護基團）。
[0057] 合成路線：
[0059] 1)將148(0.029111〇1)2-1(^-叔丁氧羰基4-芴甲氧羰基4'-甲基-卜賴氨 酸，C27H34N206)用二氯甲烷（DCM)溶解，常溫下持續(xù)通入新制HCL氣體1. 5小時后，在HCL 強酸下常溫繼續(xù)反應(yīng)5小時，薄層色譜TLC確認反應(yīng)結(jié)束；50°C，0. 03MPa條件下旋干后，得 14. 7g粘稠固體，然后進行硅膠柱層析（洗脫劑比例：DCM-DCM:MeOH= 50:1-DCM:MeOH= 20:1)得到 10. 8g(0. 0283mol) 2-2 (N-芴甲氧羰基-Ν' -甲基-L-賴氨酸，C22H26N204)。
[0060] 2) 10. 8g2-2加入30mL丙酮溶解，再加入L1MNaHC03水溶液70mL后室溫攪拌2 小時（充分攪拌，除去原料中結(jié)合的HC1)，冰水浴下緩慢加入溶有3. 93g(0. 03mol)丙酸酐 的丙酮溶液50mL，反應(yīng)1小時；反應(yīng)結(jié)束后2N鹽酸調(diào)pH至3. 0左右，加入DCMIOOmL萃取 兩次，取有機相50°C，0. 03MPa旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得12. 4g粘稠固體，進行硅膠柱層析（洗脫劑比例： DCM-DCM:MeOH= 50:1-DCM:Me0H= 30:1)得到 1(^(0.0228111〇1)2-3(^-丙酰4-芴甲氧 羰基-Ν' -甲基-L-賴氨酸，C25H3QN205)。
[0061] 3) 10g2-3加入7〇mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)和四氫呋喃（THF)溶 解后加入6mL(0.061mol)哌啶，常溫攪拌過夜，TLC確認反應(yīng)結(jié)束；油泵減壓蒸餾蒸 干（0. 88kPa)溶劑后得8g混合產(chǎn)物，進行硅膠柱層析（洗脫劑比例：DCM-DCM:MeOH= 50:1-DCM:MeOH= 30:1)，得到 3. 4g(0. 0147mol)純的酯化產(chǎn)物；加 0. 585g氫氧化鈉、 35mL7jC，35mL甲醇進行水解，冰水浴下反應(yīng)2小時，酯化產(chǎn)物完全水解后用2NHC1調(diào)pH至 3. 0。50°C，0. 03MPa旋干溶劑，再加入20mL乙醇溶解產(chǎn)物，過濾后濾液旋干，得最終產(chǎn)物 2-4(Lys(me-prop) -0H，Ν' -丙酰-Ν' -甲基-L-賴氨酸C1QH2QN203) 2. 6g。
[0062] 2、單甲基丙酰化賴氨酸化合物與載體蛋白KLH偶聯(lián)制備免疫原
[0063] (1)lOmgKLH溶于lmLMES緩沖液中；
[0064] (2)分別加入0· 4mg的EDC與1.lmgSulfo-NHS;充分混勻，室溫反應(yīng)15分鐘；
[0065] (3)隨后加入1. 4μLβ-巰基乙醇，反應(yīng)lOmin后用PBS將pH調(diào)至7. 4 ;
[0066](4) 2mgLys(me-prop)化合物溶于PBS后，加至步驟（3)中活化后的KLH溶液中， 充分混勻，室溫反應(yīng)2小時；
[0067] (5)隨后加入50mMTris反應(yīng)15min，PBS溶液中4°C透析過夜。
[0068] 3、動物免疫程序
[0069] 1)8周齡新西蘭大白兔，皮下多點注射；
[0070] 2)第一次免疫：取500μL濃度為0. 8mg/ml的KLH偶聯(lián)的小分子免疫原與同體積 完全福氏佐劑混合乳化，背部皮下多點免疫；
[0071] 3)3周后，取500μL濃度為0. 4mg/ml的免KLH偶聯(lián)的小分子疫原與同體積不完全 福氏佐劑混合乳化后，背部皮下多點注射；
[0072] 4)每隔2周，按步驟3的劑量與方法加強免疫一次；
[0073] 5)第4次免疫后10天取1ml血清，用ELISA方法檢測血清滴度。若血清滴度大于 3萬，即通過心臟采血。若血清滴度不合格，則繼續(xù)重復(fù)步驟4,直至血清滴度大于3萬。
[0074] 4、多克隆抗體純化
[0075] ProteinA預(yù)純化：
[0076] 1)滴度大于3萬的血清10mL10000r/min離心10分鐘，吸取上清用0. 45μm微孔 濾膜過濾；
[0077] 2) 3mlProteinA樹脂室溫平衡1小時，4倍柱體積的磷酸鹽緩沖液（PBS，ρΗ7· 2) 清洗樹脂；
[0078] 3)過濾后的血清20ml上樣到含有ProteinΑ樹脂的柱子中，并與ProteinΑ柱 子室溫孵育90min后，靜置15min;
[0079] 4)分別用10倍柱體積的清洗緩沖液A洗1次，15倍柱體積PBS洗柱子1次；
[0080] 5) 5倍柱體積的洗脫Buffer洗脫，隨后加入中和緩沖液，4°CPBS透析過夜；
[0081] 6)超濾IgG至濃度為 5-10mg/ml。
[0082] 抗原多肽偶聯(lián)柱子制備
[0083] 1)室溫平衡SulfoLinkCouplingResinl小時，混勻后吸取5ml于層析空柱中，4 倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液清洗兩次；
[0084] 2)稱取5mg抗原多肽，分別溶于偶聯(lián)緩沖液中，加入SulfoLinkCouplingResin 層析柱柱中混勻，室溫孵育15分鐘；
[0085] 3)靜置30分鐘，15倍柱體積的偶聯(lián)緩沖液洗柱子；
[0086] 4)加入1倍柱體積封閉緩沖液，室溫孵育15分鐘后，6倍柱體積清洗緩沖液B清 洗柱子；
[0087] 5)分別獲得含有多肽1偶聯(lián)柱子和多肽2偶聯(lián)柱子。
[0088] 抗原多肽親和純化
[0089] 將5mgProteinA預(yù)純化超濾后得到的IgG加入至抗原多肽偶聯(lián)柱子中，室溫孵 育2小時；舍棄流出液后，分別用5倍柱體積的清洗緩沖液和10倍柱體積的PBS清洗柱子， 然后按以下步驟活動純化抗體：
[0090] 1) 4倍柱體積洗脫緩沖液洗脫；
[0091] 2)洗脫液中加入中和緩沖液，透析袋中于4°CPBS透析過夜；
[0092] 3)超濾IgG至濃度為 5-10mg/ml;
[0093] 4)將上述超濾后的IgG加入至多肽2偶聯(lián)柱子中，室溫孵育30分鐘，收集流出液， 即為純化好的抗體。
[0094] 5、斑點印跡（DotBlot)檢測：
[0095] 1)將表3與表4中所列的多肽溶于水中，配置成初始濃度為100ng/μL的多肽溶 液；
[0096] 2)裁剪合適大小的PVDF膜，無水甲醇處理大約40秒，去離子水中漂洗3次，自然 干燥2分鐘；
[0097] 3)將初始濃度為100ng/μL的多肽溶液進一步分別稀釋為20ng/μL與4ng/μL。 然后依次點樣，1μ1/點，干燥10分鐘后放入六孔板中；
[0098] 4) 5%脫脂奶粉室溫封閉60分鐘，TBST洗液漂洗兩次，5分鐘/次；
[0099] 5)用5 %脫脂奶粉稀釋抗體，室溫孵育1小時，用TBST洗液漂洗三次，10分鐘/ 次；
[0100] 6)用5 %脫脂奶粉稀釋羊抗兔HRP標(biāo)記抗體，室溫45分鐘，TBST洗液漂洗三次， 10分鐘/次；
[0101] 7)將化學(xué)發(fā)光顯色液均勻鋪于膜上，孵育5分鐘后曝光，結(jié)果見圖1與圖2。
[0102] 表3 :圖1和圖4斑點印跡實驗中所用多肽的序列（Κ*表示經(jīng)過修飾的賴氨酸，其 中X為19中常見氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸）
[0103]
[0104]
[0105] 表4 :圖2和圖5斑點印跡實驗中所用多肽的序列（K*表示經(jīng)過修飾的賴氨酸，其 中X為19中常見氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸）
[0106]
[0107] 斑點印跡檢測表明，通過本發(fā)明設(shè)計的單甲基化丙酰化賴氨酸小分子作為抗原獲 得的多克隆抗體可以