0028] 圖4所示為斑點印跡實驗檢測賴氨酸單基丙?；笤磫慰寺】贵w特異性。每一 斑點印跡所對應(yīng)的上樣量為20納克。1 :賴氨酸甲基丙?；嚯膸?；2 :甲基丙?；嚢彼?小分子化合物；3 :賴氨酸甲基丙?；疓G多肽；4 :KLH偶聯(lián)的甲基丙?；嚢彼嵝》肿踊?物；5 :賴氨酸丙?；嚯膸?；6 :賴氨酸丙?；疓G多肽；7 :賴氨酸甲基乙?；嚯膸?；8 :賴 氨酸甲基乙?；疓G多肽；9 :賴氨酸甲基丁?；嚯膸?；10 :賴氨酸甲基丁?；疓G多肽；11 : 未修飾的賴氨酸多肽庫；12 :未修飾的賴氨酸GG多肽；13 :KLH。實驗中所用多肽序列見表 3及表4。
[0029] 圖5所示為斑點印跡實驗檢測賴氨酸單基丙?；笤磫慰寺】贵w特異性。。每一 斑點印跡所對應(yīng)的上樣量如圖左標(biāo)記所示。1 :賴氨酸甲基丙?；嚯膸?；2 :賴氨酸丙?；?多肽庫；3 :賴氨酸丁?；嚯膸欤? :賴氨酸單甲基化多肽庫；5 :賴氨酸二甲基化多肽庫； 6 :賴氨酸三甲基化多肽庫；實驗中所用多肽序列見表1及表2。
[0030] 圖6所示為競爭ELISA實驗檢測賴氨酸單基丙?；笤磫慰寺】贵w特異性特異 性。實驗中所用多肽序列見表1及表2。
[0031] 詳細(xì)說明
[0032] 定義
[0033] 除非另外定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的一般技 術(shù)人員所使用的術(shù)語具有相同的含義。
[0034] 賴氨酸的修飾和抗原的設(shè)計
[0035] 在一些優(yōu)選的實施方式中，在賴氨酸單甲基化修飾的基礎(chǔ)上，可以進一步對單甲 基化賴氨酸進行乙酰基、丙?；蚨□；男揎?，然后用經(jīng)過雙重修飾的小分子化合物 或多肽抗原來免疫動物可以獲得特異識別賴氨酸單甲基乙酰化（Kme-ac)、單甲基丙酰化 (Kme-prop)或單甲基丁?；↘me-buty)的抗體。
[0036] 通常，在對從生物體提取的蛋白樣品進行胰酶裂解后，可對酶解多肽進行體外衍 生化反應(yīng)，如丙?；磻?yīng)。如某條多肽中存在賴氨酸單甲基化修飾，則體外衍生化后將生成 賴氨酸單甲基化丙?；嚯摹Ｈ缓笤賹⒔?jīng)過衍生化反應(yīng)的賴氨酸單甲基化丙?；嚯暮蜕?述開發(fā)的抗體孵育，根據(jù)抗原-抗體特異性親和結(jié)合的特性，賴氨酸單甲基丙酰化抗體將 會特異性識別并富集賴氨酸單甲基化丙?；嚯摹＝?jīng)過酸洗脫將與抗體結(jié)合的賴氨酸單甲 基化丙?；嚯南疵?，通過后繼的質(zhì)譜分析可知道賴氨酸單甲基丙酰化修飾的多肽序列與 修飾位點信息，而這些信息實際上對應(yīng)的是賴氨酸單甲基化修飾的多肽序列與修飾位點， 最后通過進一步的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)搜索可以獲得賴氨酸單甲基化修飾的蛋白底物信息。
[0037] 在氨基酸上進行基團修飾是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知曉的技術(shù)，這種修飾可以從 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的修飾的自然生物體上進行分離和純化，也可以人工進行體外修飾獲得最終的經(jīng) 過修飾的氨基酸。賴氨酸根據(jù)其屬性，在體內(nèi)很容易發(fā)生多種修飾，如乙?；嚢彼?、甲基 化賴氨酸等。在體外，在優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，也可以合成特定的賴氨酸修飾形 式，如單甲基乙?；嚢彼?、單甲基丙酰化賴氨酸與單甲基丁?；嚢彼?。這種人工合成的 修飾性賴氨酸小分子，一方面可以作為小分子抗原與必要的載體蛋白偶聯(lián)免疫動物產(chǎn)生抗 血清，經(jīng)過必要的抗體純化工藝，可產(chǎn)生特異性識別該修飾賴氨酸的抗體。另一方面，以合 成的修飾性賴氨酸作為基本原料（rawmaterial)，進一步人工合成多肽抗原。該多肽抗原 與必要的載體蛋白偶聯(lián)免疫動物后產(chǎn)生抗血清，經(jīng)過必要的抗體純化工藝，可產(chǎn)生特異性 識別該修飾賴氨酸的抗體。
[0038] 人工合成的含有修飾賴氨酸多肽抗原的長度可以是修飾性賴氨酸兩側(cè)各30個氨 基酸殘基以內(nèi)。優(yōu)選的序列長度為CXnGGK*GGXn，其中X為19種常見氨基酸中除半胱氨酸 之外的任意氨基酸，η為1-20, ；K*為修飾性賴氨酸，優(yōu)選K*選自甲基丙?；?、甲基乙酰化 或甲基丁?；揎椥再嚢彼帷Ｔ谝恍﹥?yōu)選的實施方式中，Κ*為甲基丙酰化賴氨酸。在一些 優(yōu)選的實施方式中，被修飾的氨基酸可以處于多肽序列的中間位置，也可處于該多肽抗原 偏氨基端（-ΝΗ2)或羧基端（-C00H)的位置。優(yōu)選地，多肽抗原序列為CEGRGDSGGGK*GGSG。
[0039] 抗原多狀的合成
[0040] 修飾性賴氨酸多肽的合成為現(xiàn)有公知的技術(shù)。可以采用溶液法合成本發(fā)明的多 肽，也可以采用常用的固相合成法合成本發(fā)明的多肽。多肽的化學(xué)合成技術(shù)無論是液相 法還是固相法都已成熟。在一些優(yōu)選的實施方式中，合成多肽的技術(shù)為固相合成法。1978 年，ChangMeienlofer和Atherton等人米用Carpino報道的Fmoc(9_荷甲氧撰基）作為 α氨基保護基，F(xiàn)moc基對酸很穩(wěn)定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去。近年來，F(xiàn)moc 合成法得到了廣泛的應(yīng)用。在另一些優(yōu)選的方式中，采用Fmoc合成法合成本發(fā)明的肽鏈 序列（Fmoc固相多膚合成-一種實用方法（FmocSolidPhasePeptideSynthesis) -A PracticalApproach.牛津大學(xué)出版社，2000)。
[0041] 采用Fmoc合成法合成本發(fā)明的肽鏈序列基本方法是：首先將一個用Fmoc基團對 α-氨基進行保護的氨基酸通過一個支臂連結(jié)到一個不溶性載體上，隨后將α-氨基脫保 護，用溶液洗滌氨基酸一支臂一樹脂。將第二個預(yù)先活化的α-氨基保護的氨基酸通過耦 聯(lián)反應(yīng)連接上去。此外，也可以用α-Ν端及側(cè)鏈保護的肽片斷代替單個的氨基酸進行耦聯(lián) 反應(yīng)，縮合反應(yīng)完成后，用溶液洗滌，重復(fù)進行脫保護、偶聯(lián)，直到得到目的肽。最后將肽一 支臂一樹脂裂解。這種延長肽鏈的固相合成法既可采用間斷的方法，也可使用連續(xù)流動的 方法。
[0042] 抗體以及抗體的產(chǎn)牛
[0043] 這里的抗體是指通過利用本發(fā)明的修飾性賴氨酸小分子或修飾性賴氨酸多肽作 為抗原免疫動物獲得抗體。
[0044] 在一些優(yōu)選的實施方式中，在碳化二亞胺，如1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二 亞胺鹽酸鹽?DC)存在的條件下，修飾性賴氨酸小分子的羧基端（-C00H)能與N-羥基琥 珀酰亞胺磺酸（Sulfo-NHS)反應(yīng)，形成半穩(wěn)定的Sulfo-NHS酯，接著與載體蛋白的氨基端 (-NH2)偶聯(lián)（Taros,J.V.,等人，AnalBiochem，156:220-2 (1986))。本發(fā)明的小分子化合 物單甲基丙?；嚢彼幔↙ys(me-prop)-OH)，通過EDC介導(dǎo)，可以與一些載體蛋白-NH2端偶 聯(lián)，形成活化全抗原來免疫動物。在多肽全抗原的準(zhǔn)備過程中，載體蛋白上的氨基（-NH2)先 與4-(N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（sulfo-SMCC)反應(yīng)， 形成穩(wěn)定的肽鍵，隨后與抗原多肽末端的半胱氨酸反應(yīng)，通過二硫鍵形成穩(wěn)定的復(fù)合物，由 此形成活化的全抗原來免疫動物。
[0045] 在一些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的修飾性賴氨酸小分子或抗原多肽通過與載體 蛋白的偶聯(lián)而活化，帶有載體蛋白的修飾性賴氨酸小分子或多肽抗原具有更強的免疫活 性，因為單獨的修飾性賴氨酸小分子或多肽序列本身通常不具有免疫活性或免疫活性很 低。偶聯(lián)的載體蛋白可以是，但并不局限于血藍(lán)蛋白（Keyholelimpethemocyanin，KLH)、 牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin,BSA)、卵清蛋白（Ovalbumin,OVA)、牛血紅蛋白 (Bovinegammaglobulin,BGG)、牛甲狀腺蛋白（BovineThyroglobulin，BTG)、抹香嫁肌 球素（SpermWhaleMyoglobin,SWM)、破傷風(fēng)類毒素（TetanusToxoid,TT)、甲基化的牛 血清蛋白（MethylatedBovineSerumAlbumin,mBSA)、人免疫球蛋白IgG或IgA(Human immunoglobulinsIgG,IgA)或者其他現(xiàn)有技術(shù)的免疫原蛋白等等。
[0046] 用以上偶聯(lián)有活性基團的修飾性賴氨酸小分子或多肽可以來免疫動物，例如鼠， 兔，或其他哺乳動物來生產(chǎn)多克隆抗體，也可以用雜交瘤細(xì)胞來產(chǎn)生單克隆抗體，這些方 法是本領(lǐng)域現(xiàn)有公知的技術(shù)，在此不再贅述，可以參見一些教科書或免疫手冊來獲得本發(fā) 明的抗體或抗體片段（制備和使用抗體-實用手冊（MakingANDUsingAntibodies-A practicalhandbook).CRCPress, 2007)。當(dāng)然，抗體也可以經(jīng)過自然產(chǎn)生，也可以是經(jīng)過人 工合成的抗體或抗體片段。這些抗體可以特異識別包括經(jīng)過修飾的賴氨酸殘基，而與其周 邊序列無關(guān)。在一些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗體可以特異識別某一含有單甲基丙酰 化修飾的賴氨酸多肽，而不能識別那些含有其他賴氨酸修飾形式的多肽。所謂"特異性"是 指該抗體僅能識別或結(jié)合某一特定類型的抗原，而不識別或結(jié)合其他類型的抗原。在本發(fā) 明中，所制備的抗體只是識別單甲基丙?；揎椀馁嚢彼岬碾逆溞蛄?，而不能識別其它類 型賴氨酸修飾的多肽序列，如包括但不局限于賴氨酸二甲基化，三甲基化，乙?；?、丙?；?、 丁?；揎棧蚱渌被釟埢男揎椥问?，如酪氨酸磷酸化等。
[0047] 作為結(jié)合或識別賴氨酸甲基丙酰化修飾的抗體可以是本發(fā)明的抗體?？贵w可以是 免疫球蛋白分子或部分抗原特定位點的免疫球蛋白分子，例如那些具有抗原結(jié)合位點的分 子能夠特異（被免疫）結(jié)合被分析物質(zhì)，被分析物質(zhì)的擬態(tài)物質(zhì)或配體?？贵w也包括人工 合成的雜交抗體或者經(jīng)過修飾過的抗體或抗體分子片段，包括，但不局限于，抗體片段和Fv 片段。具有結(jié)合抗原功能的抗體上具有自然發(fā)生的