ProteinG柱子中，室溫孵育2小時；
[0165] 4)靜置15分鐘后，放出腹水，15倍柱體積的PBS洗滌柱子；
[0166] 5)用6倍柱體積的甘氨酸洗脫液洗脫，收集并加入中和緩沖液，PBS中4°C透析過 夜。
[0167] 7、斑點(diǎn)印跡（DotBlot)檢測：
[0168] 1)將表3與表4中所列的多肽溶于水中，配置成初始濃度為100ng/μL的多肽溶 液；
[0169] 2)裁剪合適大小的PVDF膜，無水甲醇處理大約40秒，去離子水中漂洗3次，自然 干燥2分鐘；
[0170] 3)將初始濃度為100ng/μL的多肽溶液進(jìn)一步分別稀釋為20ng/μL與4ng/μL。 然后依次點(diǎn)樣，1μ1/點(diǎn)，干燥10分鐘后放入六孔板中；
[0171] 4) 5%脫脂奶粉室溫封閉60分鐘，TBST洗液漂洗兩次，5分鐘/次；
[0172] 5)用5 %脫脂奶粉稀釋抗體，室溫孵育1小時，用TBST洗液漂洗三次，10分鐘/ 次；
[0173] 6)用5 %脫脂奶粉稀釋羊抗兔HRP標(biāo)記抗體，室溫45分鐘，TBST洗液漂洗三次， 10分鐘/次；
[0174] 7)將化學(xué)發(fā)光顯色液均勻鋪于膜上，孵育5分鐘后曝光，結(jié)果見圖3與圖4。
[0175] 斑點(diǎn)印跡檢測表明，通過本發(fā)明設(shè)計(jì)的CEGRGDSGGGK*GGSG多肽作為抗原獲得的 單克隆抗體可以特異性識別賴氨酸甲基丙酰化多肽庫，甲基丙酰化賴氨酸小分子化合物， 賴氨酸甲基丙?；疓G多肽與KLH偶聯(lián)的甲基丙?；嚢彼嵝》肿踊衔铮⒉蛔R別其他 類型賴氨酸修飾的多肽（圖4)，由此說明了抗體良好的特異性。圖5的結(jié)果表明，所開發(fā)的 單甲基化丙?；嚢彼釂慰寺】贵w能夠識別4納克的賴氨酸甲基丙?；嚯膸?，但不識別 結(jié)構(gòu)類似的直至100納克的其他修飾性賴氨酸多肽庫，這既表明所開發(fā)抗體的靈敏度，也 進(jìn)一步表明了該多克隆抗體的特異性。
[0176] 8、ELISA檢測：
[0177] 1)包被：用去離子水稀釋CEGRGDSGGGK*GGSG抗原多肽至1X10 3mg/mL，50y1/孔， 4 °C包被酶標(biāo)板過夜；
[0178] 2)封閉：第二天用TBST洗 1 次，5 分鐘 / 次，200μ1/孔，拍干，1%BSA/TBS70y1 封閉45分鐘；
[0179] 3)競爭：純化的賴氨酸單甲基化丙?；瘑慰寺】贵w用PBS1:200稀釋，隨后分別加 入0納克，10納克，50納克和100納克表1及表2中所列舉多肽，4°C反應(yīng)過夜；
[0180] 4)加入純化的賴氨酸單甲基化丙?；瘑慰寺】贵w：第二日，3000g離心取上清，稀 釋10倍，加入到酶標(biāo)板中，50μ1/孔。26°C孵育2小時。
[0181] 5)加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗：TBST洗3次，5分鐘/次，200μ1/孔，拍干，加 入二抗，1:10000 稀釋（1 %BSA/TBS)，50μ1/ 孔，26°C孵育 45 分鐘。
[0182] 6)加底物：按步驟5的方法，TBST洗3次，拍干。50μ1/孔加入TMB顯色底物， 26 °C反應(yīng)30分鐘；
[0183] 7)終止：加入2M硫酸，50μ1/孔。
[0184] 8)顯色：酶標(biāo)儀0D450測定吸光度。
[0185] 從圖6的結(jié)果可以看出，逐漸提高與純化抗體相競爭的賴氨酸甲基丙?；嚯?庫、賴氨酸甲基丙?；乖嚯牡牧浚贵w與預(yù)包被的賴氨酸甲基丙?；乖嚯姆磻?yīng)的 ELISA信號也隨之逐漸降低，而與其他修飾性賴氨酸多肽競爭后抗體則與預(yù)包被的賴氨酸 甲基丙酰化抗原多肽反應(yīng)的ELISA信號基本保持不變，由此進(jìn)一步說明所開發(fā)的賴氨酸單 甲基化丙?；瘑慰寺】贵w的特異性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種修飾性單甲基賴氨酸，其中，經(jīng)過修飾性的單甲基賴氨酸的結(jié)構(gòu)如下：其中，R為修飾基團(tuán)，R為其中，R1為碳原子數(shù)小于6個的烷基或者碳原子數(shù)小于8個的芳香基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的賴氨酸，其中，R為磺?；?其中R2為碳原子數(shù)小于6 個的烷基或者碳原子數(shù)小于8個的芳香基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的賴氨酸，R為乙酰基或丁?；?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的賴氨酸，R為丙?；?. 根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的賴氨酸，所述的賴氨酸可以偶聯(lián)到載體蛋白形成免疫 原。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的賴氨酸，所述載體蛋白包括但不限于，血藍(lán)蛋白（KLH)、牛血 紅蛋白（BGG)、牛血清蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)。7. -種多肽，該多肽包括一個或一個以上修飾性單甲基賴氨酸，其中，經(jīng)過修飾性的單 甲基賴氨酸的結(jié)構(gòu)如下：其中，R為修飾基團(tuán)，R為其中，R1為碳原子數(shù)小于6個的烷基或者碳原子數(shù)小 于8個的芳香基；或者，R為磺酰基其中R2為碳原子數(shù)小于6個的烷基或者碳原子數(shù)小于8個的芳香基。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽，R為乙?；?或丁?；?. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽，R為丙酰基10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9之一所述的多肽，其中多肽的序列為CXnGGK*GGXn，或者CX nK*Xn， 其中X為19中常見氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸，η為1-20 ;GGK*GG為一特定 基序，K*表示為所述經(jīng)過修飾性的單甲基賴氨酸。11. 根據(jù)權(quán)利要求7-10之一所述的多肽，該多肽為一條含有一個由2到6個氨基酸殘 基構(gòu)成的特定基序（motif)的多肽庫，其中該基序中含有一個或一個以上的修飾性ε-胺 基酰單甲基賴氨酸。12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽，多肽的序列為CEGRGDSGGGK*GGSG，K*表示為所述經(jīng) 過修飾性的單甲基賴氨酸。13. 根據(jù)權(quán)利要求7-12之一所述的多肽，其中所述的多肽被偶聯(lián)到載體蛋白作為抗原 產(chǎn)生抗體。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的多肽，所述的載體蛋白包括血藍(lán)蛋白（KLH)、牛血紅蛋白 (BGG)、牛血清蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)。15. -種抗體，其特征在于，該抗體是通過權(quán)利要求7-14之一所述的多肽，或權(quán)利要求 1-6之一所述的經(jīng)過修飾的賴氨酸小分子免疫動物獲得的。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其中動物為包括但不限于兔子，小鼠，山羊，駱駝， 駝羊、雞。17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。18. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，該抗體能夠特異識別并結(jié)合修飾性酰單甲基賴氨酸 多肽，該多肽包括一個或一個以上的權(quán)利要求1所述的酰單甲基賴氨酸。19. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，該抗體可以通過權(quán)利要求1-6之一所述的修飾性單 甲基賴氨酸從噬菌體展示庫、酵母展示庫、細(xì)菌展示庫以及核糖體展示庫中篩選制備而成。20. 根據(jù)權(quán)利要求所述的抗體，其中該抗體為保藏號為CGMCC勵.9109的？11'-001細(xì)胞 株產(chǎn)生的抗體。21. -種生產(chǎn)蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的ε-胺基上酰單甲基化特有親和試劑的方法，該方 法包括：1)制備含有賴氨酸殘基的ε -胺基酰甲基化的化合物，多肽或者蛋白2)采用含有 賴氨酸殘基的ε -胺基酰甲基化的化合物，多肽或者蛋白同過免疫學(xué)的方法去生產(chǎn)賴氨酸 殘基的ε-胺基上酰單甲基化特有親和試劑。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，將ε-胺基酰甲基化賴氨酸或者ε-胺基酰甲基化 賴氨酸類似物偶聯(lián)到載體蛋白上作為抗原產(chǎn)生抗體。23. 根據(jù)權(quán)利要求21-22之一的方法，ε-胺基酰甲基化賴氨酸的結(jié)構(gòu)如下：其中，一R為修飾基團(tuán)，1)R戈其中，R1為碳原子數(shù)小于6個的烷基或者碳原子 數(shù)小于8個的芳香基；或者，2) R為磺?；渲蠷2為碳原子數(shù)小于6個的烷基，或者 碳原子數(shù)小于8個的芳香基。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，使用賴氨基酸單甲基化衍生化多肽作為抗原，其序 列為CXnGGK*GGXn，或者CXnK*Xn，其中X為19中常見氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基 酸，η為1-20 ;GGK*GG為一特定基序，K*表示為所述的ε -胺基酰甲基化賴氨酸。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，該多肽為一條含有一個由2到6個氨基酸殘基構(gòu)成 的特定基序（motif)的多肽庫，其中該基序中含有一個或一個以上的修飾性ε-胺基酰單 甲基賴氨酸。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，多肽的序列為CEGRGDSGGGK*GGSG，Κ*選自單甲基乙 ?；?、單甲基丙?；騿渭谆□；揎椥再嚢彼幔粌?yōu)先地，K*為單甲基丙?；嚢彼?。27. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，在所述的ε-胺基酰甲基化賴氨酸分子上連接有載 體蛋白，所述載體蛋白包括但不限于血藍(lán)蛋白（KLH)、牛血紅蛋白（BGG)、牛血清蛋白（BSA) 或卵清蛋白（OVA)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及人工合成的修飾性單甲基化賴氨酸，以及修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽。本發(fā)明還涉及用該修飾性單甲基化賴氨酸，以及修飾性單甲基化賴氨酸衍生化多肽作為抗原產(chǎn)生一種全新的抗體，該抗體可用于識別與富集賴氨酸單甲基化多肽發(fā)生體外衍生化后的修飾性多肽。利用該抗體可以檢測多肽序列上的氨基酸是否存在單甲基化修飾，本發(fā)明還涉及所述抗體的制備方法。CGMCC NO910920140422
【IPC分類】C07K14/765, C07K19/00, C07K16/00, C07K14/795, C07C231/12, C07K7/08, C07K14/77, C07C233/47, C07K14/805
【公開號】CN105273060
【申請?zhí)枴緾N201410359860
【發(fā)明人】程仲毅
【申請人】杭州景杰生物科技有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年7月25日