用于控制蛋白質(zhì)中的巖藻糖基化水平的方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年7月23日向印度專利局提交的印度臨時(shí)專利申請(qǐng)3262/ CHE/2013及在2013年7月23日向印度專利局提交的印度臨時(shí)專利申請(qǐng)3265/CHE/2013的 權(quán)益及優(yōu)先權(quán)。依據(jù)專利合作條約實(shí)施細(xì)則4. 18,為了所有目的，2013年7月23日提交的 所述申請(qǐng)的內(nèi)容整體援引加入到本文中，包括加入未包含在本文中并在專利合作條約實(shí)施 細(xì)則20. 5 (a)中提到的結(jié)論、權(quán)利要求書(shū)或附圖的任何項(xiàng)目或部分。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于控制蛋白質(zhì)中的巖藻糖基化水平的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 在真核生物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)歷涉及糖基化的翻譯后修飾過(guò)程?，F(xiàn)今已 被建立用于產(chǎn)生糖蛋白（如IgG及其它包含F(xiàn)c區(qū)域的單克隆抗體）的真核生物表達(dá)系統(tǒng) 將N-聚糖添加至多肽鏈。
[0006] 在IgG中，最重要的N-聚糖連接至兩條CH2鏈的Asn297處（參見(jiàn)圖14)，其尤其 包括N-乙?；?神經(jīng)氨酸（唾液酸）、N-乙?；?葡糖胺、半乳糖、甘露糖及巖藻糖殘基。
[0007] 這基本上適用于轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)以及適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、昆蟲(chóng)細(xì)胞系 等。在所有這些情況下，N-聚糖包含至少一個(gè)巖藻糖殘基，其以α-3-糖苷或α-6-糖苷 連接至與多肽鏈的Asn殘基連接的N-乙?；?葡糖胺殘基。
[0008] 酵母表達(dá)系統(tǒng)易于產(chǎn)生富含甘露糖的高糖蛋白，其在治療性抗體被施用至患者時(shí) 常常導(dǎo)致非期望的免疫反應(yīng)。桿狀病毒轉(zhuǎn)染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)因低糖基化而引起問(wèn)題，其負(fù) 面地影響治療性抗體的效應(yīng)子功能。此外，主要的缺點(diǎn)是感染性桿狀病毒的催化性質(zhì)，其使 得用于完整IgG生產(chǎn)的范圍（window)變窄。
[0009] ADCC是細(xì)胞介導(dǎo)免疫的機(jī)制，藉此免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞主動(dòng)地裂解已被特異性抗 體結(jié)合的靶細(xì)胞。它是作為體液免疫反應(yīng)的一部分的抗體可以通過(guò)其作用來(lái)限制及遏制感 染的多種機(jī)制中的一種。經(jīng)典的ADCC介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞是自然殺傷（NK)細(xì)胞；但單核細(xì)胞 和嗜酸性粒細(xì)胞也可以介導(dǎo)ADCC。由于其依賴于先前的抗體反應(yīng)，所以ADCC是適應(yīng)性免疫 反應(yīng)的一部分。
[0010] 用于在靶細(xì)胞中引發(fā)ADCC的治療性抗體需要Fc區(qū)域，以被所述效應(yīng)細(xì)胞的Fc γ 受體所識(shí)別。
[0011] 近來(lái)的研究已顯示，相較于巖藻糖基化抗體，在其糖基化模式中具有減少量的巖 藻糖的單克隆抗體顯示出高得多的抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)活性。再次，巖藻糖殘基的 缺乏導(dǎo)致增加的ADCC的位置基本上是Asn297位置。低/無(wú)巖藻糖抗體的ADCC增加的機(jī) 制似乎是由如此修飾的Fc區(qū)域針對(duì)Fc γ R(例如，F(xiàn)c γ IIIa(CD16)，其是在人免疫效應(yīng)細(xì)胞 中針對(duì)ADCC的主要Fc受體）的親和力增加所介導(dǎo)的（Shields等人，2002)。
[0012] 巖藻糖基化是牽涉糖蛋白或糖脂上的寡糖的最常見(jiàn)修飾中的一種。巖藻糖基化包 括將巖藻糖殘基附接至N-聚糖、0-聚糖及糖脂。0-巖藻糖基化（一種特殊類型的巖藻糖 基化）對(duì)于Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)非常重要。巖藻糖基化的調(diào)控機(jī)制是復(fù)雜的。許多種類的巖藻 糖基轉(zhuǎn)移酶、GDP-巖藻糖合成途徑及GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了巖藻糖基化的調(diào)控。
[0013] 已知糖基化影響治療性單克隆抗體的效應(yīng)子功能。在抗體的寡糖鏈中的不同糖殘 基中，巖藻糖是影響由產(chǎn)物誘導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)的關(guān)鍵糖類之一。
[0014] 通常使用細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)的操作來(lái)控制抗體的半乳糖苷化及唾液酸化。巖藻糖基化 的控制主要通過(guò)使用FUT8敲除細(xì)胞和其它基因沉默模型通過(guò)細(xì)胞系工程改造來(lái)完成。
[0015] US20090208500公開(kāi)了通過(guò)操作FUT8敲除細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生具有減少的巖藻糖和改善 的Fc功能的抗體。
[0016] US7972810公開(kāi)了細(xì)胞培養(yǎng)方法和含錳培養(yǎng)基，其改善糖蛋白（包括紅細(xì)胞生成 素及其類似物或衍生物）的糖基化或唾液酸化。根據(jù)該公開(kāi)內(nèi)容，錳增加了唾液酸化和在 〇-連接及N-連接糖基化的情況下的位點(diǎn)占用（即較少的非糖基化產(chǎn)物），而且還增加末端 半乳糖苷化。
[0017] 此外，可以由培養(yǎng)基滲透壓來(lái)控制單克隆抗體的巖藻糖含量以用于高抗體依賴性 細(xì)胞毒性（Konno等人，2012) 〇
[0018] 然而，存在對(duì)于在所需細(xì)胞系中產(chǎn)生糖蛋白同時(shí)控制重組工程改造抗體的巖藻糖 含量而無(wú)需每次經(jīng)歷在所選細(xì)胞系中產(chǎn)生FUT8基因敲除的費(fèi)力過(guò)程的有效方法的需要。
[0019] 發(fā)明的實(shí)施方案
[0020] 這些目標(biāo)通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的獨(dú)立權(quán)利要求的方法和手段得到滿足。從屬權(quán)利 要求涉及優(yōu)選實(shí)施方案。還應(yīng)理解，由數(shù)值限定的取值范圍應(yīng)被理解為包含該限定值。
[0021] 發(fā)明概述
[0022] 在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限制于所描述的裝置的特定組成部分 或所描述的方法的特定工藝步驟，因?yàn)檫@樣的裝置以及方法可發(fā)生變化。還應(yīng)理解，本文使 用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方案的目的，并不意欲進(jìn)行限制。必須注意，如在說(shuō)明書(shū)及 所附權(quán)利要求書(shū)中所使用的，除非上下文另外地清楚指明，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所 述"包括單數(shù)和/或復(fù)數(shù)對(duì)象。此外，還應(yīng)理解，在通過(guò)數(shù)值限定給出參數(shù)范圍時(shí)，該范圍被 視為包括這些限定值。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種用于在真核生物和/或真核生物的蛋白 質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中修飾巖藻糖基化的方法或過(guò)程，在該方法或過(guò)程中，控制培養(yǎng)基中的錳或錳 離子的總濃度。
[0024] 糖蛋白的巖藻糖基化是由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FUT)完成的。這些酶是將L-巖藻糖 從GDP-巖藻糖（鳥(niǎo)苷二磷酸巖藻糖）供體底物轉(zhuǎn)移至受體底物的酶。受體底物可以是另 一種糖，例如在N-連接糖基化的情況下將巖藻糖轉(zhuǎn)移至核心GlcNAc (N-乙?；咸前罚┨?或是在由〇-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的〇-連接糖基化的情況下將巖藻糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)。在哺 乳動(dòng)物中有不同的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其中絕大多數(shù)位于高爾基體。最近已顯示〇-巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)。哺乳動(dòng)物巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的實(shí)例是FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、 FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9、FUT10 及 FUT11。
[0025] 盡管錳的作用還未被完全理解，錳是參與許多酶系統(tǒng)的必需微量元素。它在對(duì)于 能量產(chǎn)生是必需的酶中用作輔因子，并且涉及葡萄糖的代謝作用、肝臟中的糖原儲(chǔ)存、蛋白 質(zhì)消化作用以及膽固醇及脂肪酸的合成。它對(duì)于DNA和RNA分子的合成也是必需的。
[0026] 錳對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)及維護(hù)、骨和關(guān)節(jié)的發(fā)育及維護(hù)、雌性性激素及甲狀腺激 素的功能是必需的。超氧化物歧化酶（SOD，MnSOD)是一種在其結(jié)構(gòu)中含有錳的抗氧化酶。
[0027] 在細(xì)胞外液體或真核生物中，錳實(shí)際上不存在，然而在哺乳動(dòng)物中，錳的細(xì)胞內(nèi)濃 度是在0. 010皮克/細(xì)胞至0. 10皮克/細(xì)胞的范圍內(nèi)。
[0028] 然而，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，錳的濃度對(duì)于糖蛋白的巖藻糖基化水平具有直 接效應(yīng)。
[0029] 因此，本發(fā)明提供用于通過(guò)在過(guò)程中改變培養(yǎng)基及進(jìn)料中的錳或錳離子的總濃度 來(lái)修改糖基化蛋白質(zhì)的巖藻糖含量。
[0030] 優(yōu)選地，該方法或過(guò)程是降低巖藻糖基化的方法或過(guò)程。在這樣的方法或過(guò)程中， 蛋白質(zhì)表達(dá)和/或翻譯后修飾是在存在升高的錳或錳離子的總濃度的情況下進(jìn)行的。
[0031] 出人意料地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在這樣的條件下，所表達(dá)的糖蛋白具有降低的巖藻糖 基化水平。此外，他們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)、存活力及所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的滴度未受錳或錳離子濃 度升高的影響。
[0032] 此外，他們發(fā)現(xiàn)，糖基化模式的其它性質(zhì)（即GO以及Man5)在存在升高的錳或錳 離子的總濃度的情況下增加。
[0033] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"巖藻糖基化水平"意指其中聚糖攜帶巖藻糖的糖蛋白的總 量。同樣地，術(shù)語(yǔ)"非巖藻糖基化水平"以及"非巖藻糖基化百分比"意指在其聚糖中沒(méi)有 巖藻糖的糖蛋白的百分比。
[0034] 在根據(jù)本發(fā)明的方法或過(guò)程的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的升高的錳或錳離子濃度是 在彡0· 05mM至彡IOmM的范圍內(nèi)。
[0035] 優(yōu)選地，升高的錳或錳離子濃度為 0. 05 ;0. 1 ;0. 15 ;0. 2 ;0. 25 ;0. 3 ;0. 35 ;0. 4 ; 0· 45 ;0· 5 ;0· 55 ;0· 6 ;0· 65 ;0· 7 ;0· 75 ;0· 8 ;0· 85 ;0· 9 ;0· 95 ;1 ;1· 05 ;1. 1 ;1· 15 ;1· 2 ; 1. 25 ；1. 3 ；1. 35 ；1. 4 ；1. 45 ；1. 5 ；1. 55 ；1. 6 ；1. 65 ；1. 7 ；1. 75 ；1. 8 ；1. 85 ；1. 9 ；1. 95 ；2 ； 2. 05 ；2. I ；2. 15 ；2. 2 ；2. 25 ；2. 3 ；2. 35 ；2. 4 ；2. 45 ；2. 5 ；2. 55 ；2. 6 ；2. 65 ；2. 7 ；2. 75 ；2. 8 ； 2. 85 ;2· 9 ;2· 95 ;3 ;3· 05 ;3· 1 ;3· 15 ;3· 2 ;3· 25 ;3· 3 ;3· 35 ;3· 4 ;3· 45 ;3· 5 ;3· 55 ;3· 6 ; 3. 65 ；3. 7 ；3. 75 ；3. 8 ；3. 85 ；3. 9 ；3. 95 ；4 ；4. 05 ；4. I ；4. 15 ；4. 2 ；4. 25 ；4. 3 ；4. 35 ；4. 4 ； 4. 45 ；4. 5 ；4. 55 ；4. 6 ；4. 65 ；4. 7 ；4. 75 ；4. 8 ；4. 85 ；4. 9 ；4. 95 ；5 ；5. 05 ；5. I ；5. 15 ；5. 2 ；