培養(yǎng)基和通過進(jìn)料加入使非巖藻糖基化水平的增加。非巖藻 糖基化特征譜對應(yīng)于在〇. lmM、〇. 2mM及0. 25mM的情況下的第10天樣品；以及在0. 075mM 及0. 23mM的情況下的第11天樣品。結(jié)果概述于以下表中：
[0152] 表6 :使用0. lmM、0. 2mM和0. 25mM錳（Mn)濃度的10天振蕩瓶試驗(yàn)的聚糖特征譜
[0154] 表7 :使用0. 075mM和0. 23mM Mn濃度11天50L批次運(yùn)行的聚糖特征譜
[0156] 基于以上實(shí)驗(yàn)，隨著錳的總濃度的增加觀察到非巖藻糖基化百分比的增加。細(xì)胞 生長、存活力和IgG滴度特征譜未受Mn添加的影響。
[0157] 圖12 :通過加入錳（Mn)增加 GO、Man5和非巖藻糖基化水平。
[0158] 通過改變在培養(yǎng)基中的濃度來測試錳在0. 0025 μΜ至0. 5mM的范圍中的效應(yīng)。沒 有通過進(jìn)料來加入錳。試驗(yàn)在振蕩瓶中進(jìn)行，并且在第8天針對糖基化特征譜來分析樣品。 可以觀察到，隨著錳濃度的增加，G0、Man5和非巖藻糖基化水平也逐步增加。
[0159] 圖13 :銅濃度不具有對巖藻糖基化的效應(yīng)。
[0160] 為了評估其它二價(jià)陽離子的效應(yīng)，選擇Cu用于研究，因?yàn)镃u也是在糖基化途徑中 的輔因子（針對唾液酸轉(zhuǎn)移酶）。在振蕩瓶中測試在培養(yǎng)基中〇. 01 μ M至200 μ M范圍內(nèi)的 不同銅濃度。如圖3所示，沒有觀察到以任何值的增加/效應(yīng)（G0、Man5和非巖藻糖基化）。 這證實(shí)銅離子不影響蛋白質(zhì)中的非巖藻糖基化水平。
[0161] 圖14 :免疫球蛋白G的示意圖。
[0162] 圖14顯示免疫球蛋白G(IgG)的示意圖。IgG包含兩條相同的輕鏈（各自包含兩 個(gè)結(jié)構(gòu)域，VJPV h)和兩條相同的重鏈（各自包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域，VH、CH1、CH2和C H3)?？贵w結(jié) 合表面由重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域形成，并且效應(yīng)子功能（例如補(bǔ)體活化以及結(jié)合細(xì)胞毒 性細(xì)胞）由抗體的Vc區(qū)域介導(dǎo)。
[0163] 圖15 :N-聚糖結(jié)構(gòu)的命名法。
[0164] 圖15顯示不同N-聚糖的概述。一般地，術(shù)語"N-糖基化"意指氨基酸殘基天冬 酰胺（N)的糖基化。這里，寡糖鏈由寡糖基轉(zhuǎn)移酶附接至存在于三肽序列Asn-X-Ser或 Asn-X-Thr中的那些天冬酰胺殘基，其中X可以是除了 Pro之外的任何氨基酸。
[0165] 本文顯示的實(shí)驗(yàn)清楚地證實(shí)：
[0166] a)糖蛋白的巖藻糖含量可以通過在蛋白質(zhì)表達(dá)過程中改變培養(yǎng)基和進(jìn)料中的錳 或錳離子的總濃度而進(jìn)行操縱。
[0167] b)增加錳或錳離子的總濃度導(dǎo)致糖蛋白的非巖藻糖基化增加或?qū)е绿堑鞍椎奶?基化模式中的巖藻糖含量降低。
[0168] c)在免疫配體（如具有Fc區(qū)域的抗體）中，在存在升高的錳或錳離子濃度的情況 下的蛋白質(zhì)表達(dá)導(dǎo)致了（i)較高的非巖藻糖基化程度以及（ii)增加的ADCC。
[0169] d)在這些免疫配體中，增加非巖藻糖基化程度不導(dǎo)致增加的⑶C。
[0170] e)相反地，免疫配體（如具有Fc區(qū)域的抗體）的去糖基化不導(dǎo)致增加的ADCC。
[0171] f)除了非巖藻糖基化，免疫配體（如具有Fc區(qū)域的抗體）的去糖基化可以導(dǎo)致這 樣的免疫配體的功能活性的喪失，特別是如果這樣的功能活性與如效應(yīng)子功能和/或ADCC 的活性有關(guān)的話。
[0172] 參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于修飾真核生物和/或真核生物的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中的巖藻糖基化的方法 或過程，在所述方法或過程中控制培養(yǎng)基中的錳或錳離子的總濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法或過程，所述方法或過程是減少巖藻糖基化的方法或過 程，并且在所述方法或過程中，蛋白質(zhì)表達(dá)和/或翻譯后修飾是在存在升高的錳或錳離子 的總濃度的情況下進(jìn)行的。3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，所述升高的錳或錳 離子的總濃度在彡0. 05mM至彡10mM的范圍內(nèi)。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，所述蛋白質(zhì)表達(dá)和 /或翻譯后修飾是在選自昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、原生動(dòng)物細(xì)胞和/或哺乳動(dòng)物細(xì) 胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行的。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，所述蛋白質(zhì)是糖蛋 白。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，所述蛋白質(zhì)是重組 蛋白。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，所述蛋白質(zhì)是免疫 配體。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，所述免疫配體是選 自下述的至少一種：鼠、嵌合、人源化、人的單克隆抗體或其衍生物、新抗體形式、由融合至 靶結(jié)合部分例如受體片段的免疫球蛋白Fc區(qū)域組成的融合肽。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，相較于在不存在升 高的錳或錳離子濃度的情況下表達(dá)的免疫配體，所述免疫配體具有降低的巖藻糖基化程 度。10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，相較于（i)在不 存在升高的錳或錳離子濃度的情況下表達(dá)的或（ii)具有較高的巖藻糖基化程度的免疫配 體，所述免疫配體顯示增加的ADCC活性。11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，所述免疫配體靶向 牽涉細(xì)胞介導(dǎo)免疫防御的一種或多種細(xì)胞表面抗原。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程，在所述方法中，所述免疫配體是 Itolizumab〇13. -種糖蛋白，其通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或過程產(chǎn)生。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的糖蛋白，所述糖蛋白是重組蛋白。15. 根據(jù)權(quán)利要求13至14中任一項(xiàng)所述的糖蛋白，所述糖蛋白是免疫配體，優(yōu)選地是 抗體。16. 根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的糖蛋白，所述糖蛋白或其子結(jié)構(gòu)域在其巖藻 糖基化模式中具有減少的巖藻糖含量。17. 根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的糖蛋白，所述糖蛋白或其子結(jié)構(gòu)域具有約 35 %的非巖藻糖基化水平。18. 根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)所述的糖蛋白，所述糖蛋白具有增加的ADCC。19. 根據(jù)權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)所述的糖蛋白，所述糖蛋白是Itolizumab。20. 根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項(xiàng)所述的糖蛋白，所述糖蛋白實(shí)現(xiàn)對于⑶25和⑶4 呈陽性的細(xì)胞特別是CD4+T細(xì)胞在體外或體內(nèi)的減少。21. 根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述的糖蛋白用于制造治療人或動(dòng)物患者的藥物 的用途。22. 根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述的糖蛋白用于治療人或動(dòng)物患者的用途。23. 根據(jù)權(quán)利要求21至22中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述人或動(dòng)物患者患有選自以下 的疾病或已被診斷為處于發(fā)生選自以下的疾病的風(fēng)險(xiǎn)中： ?腫瘤疾病，包括腫瘤、淋巴瘤及白血病，特別是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血?。˙-CLL) 和T細(xì)胞白血??； ?自身免疫疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀肩病、克羅恩氏病、紅斑狼瘡、舍格倫??； ?神經(jīng)退行性疾病，包括多發(fā)性硬化、帕金森氏病、阿爾茨海默病、亨廷頓病和/或肌萎 縮側(cè)索硬化； ?感染性疾病。24. 根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)的用途，其用于治療或預(yù)防已進(jìn)行移植的人或動(dòng)物 中的不良反應(yīng)如移植物抗宿主?。℅VHD)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于控制、抑制或減少真核動(dòng)物和/或真核動(dòng)物的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)巖藻糖基化的方法或過程。所述方法包括在存在升高的錳或錳離子總濃度的情況下進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和/或翻譯后修飾。
【IPC分類】C07K16/00, C12N5/00, C07K14/00, C12N1/00
【公開號】CN105392878
【申請?zhí)枴緾N201480041292
【發(fā)明人】P·納伊爾, R·梅拉克德, R·文卡塔拉曼, L·阿迪卡瑞, A·彼哈特納噶, S·普拉布胡, K·舒克拉, D·巴斯卡, S·德桑, H·V·派, J·E·蒙特羅卡西米洛
【申請人】百康有限公司, 分子免疫中心
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2014年7月23日
【公告號】CA2926967A1, EP3024922A1, US20160138065, WO2015011660A1