5. 25 ；5. 3 ；5. 35 ；5. 4 ；5. 45 ；5. 5 ；5. 55 ；5. 6 ；5. 65 ；5. 7 ；5. 75 ；5. 8 ；5. 85 ；5. 9 ；5. 95 ；6 ； 6. 05 ;6. 1 ;6· 15 ;6· 2 ;6· 25 ;6· 3 ;6· 35 ;6· 4 ;6· 45 ;6· 5 ;6· 55 ;6· 6 ;6· 65 ;6· 7 ;6· 75 ;6· 8 ; 6. 85 ；6. 9 ；6. 95 ；7 ；7. 05 ；7. I ；7. 15 ；7. 2 ；7. 25 ；7. 3 ；7. 35 ；7. 4 ；7. 45 ；7. 5 ；7. 55 ；7. 6 ； 7. 65 ；7. 7 ；7. 75 ；7. 8 ；7. 85 ；7. 9 ；7. 95 ；8 ；8. 05 ；8. I ；8. 15 ；8. 2 ；8. 25 ；8. 3 ；8. 35 ；8. 4 ； 8. 45 ;8· 5 ;8· 55 ;8· 6 ;8· 65 ;8· 7 ;8· 75 ;8· 8 ;8· 85 ;8· 9 ;8· 95 ;9 ;9· 05 ;9. 1 ;9· 15 ;9· 2 ; 9. 25 ;9· 3 ;9· 35 ;9· 4 ;9· 45 ;9· 5 ;9· 55 ;9· 6 ;9· 65 ;9· 7 ;9· 75 ;9· 8 ;9· 85 ;9· 9 ;9· 95 ;或 IOmM0
[0036] 這些濃度意指在發(fā)生蛋白質(zhì)表達(dá)和/或翻譯后修飾的培養(yǎng)基中的總濃度。這意味 著，例如，進(jìn)料液（feed solutions)可以具有顯著較高的猛或猛離子濃度。
[0037] 優(yōu)選地，錳的濃度是通過(guò)將錳加至培養(yǎng)基和/或進(jìn)料培養(yǎng)基來(lái)完成的。
[0038] 同樣優(yōu)選地，在蛋白質(zhì)表達(dá)和/或翻譯后修飾期間，錳濃度增加或降低。
[0039] 在根據(jù)本發(fā)明的方法或過(guò)程的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是，在選自以下的蛋白質(zhì) 表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和/或翻譯后修飾：
[0040] ?昆蟲(chóng)細(xì)胞；
[0041] ?真菌細(xì)胞；
[0042] ?酵母細(xì)胞；
[0043] ?原生動(dòng)物細(xì)胞；和/或
[0044] ?哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0045] 優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自鼠細(xì)胞（例如，NS0)、倉(cāng)鼠細(xì)胞（例如，CHO或BHK)和 /或人類細(xì)胞（例如，PER. C6)。
[0046] 優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是糖蛋白。更優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是重組蛋白。
[0047] 在根據(jù)本發(fā)明的方法或過(guò)程的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是，蛋白質(zhì)是免疫配體。
[0048] 本文所使用的術(shù)語(yǔ)"免疫配體"意指具有以足夠程度的靈敏度和/或特異性與另 一生物學(xué)實(shí)體結(jié)合的能力的實(shí)體。
[0049] 在根據(jù)本發(fā)明的方法或過(guò)程的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是，免疫配體是選 自以下的至少一種：
[0050] ?單克隆抗體（鼠、嵌合、人源化、人）或其衍生物
[0051] ?新的抗體形式
[0052] ?由融合至靶結(jié)合部分（例如受體片段）的免疫球蛋白Fc區(qū)域組成的融合肽。
[0053] 優(yōu)選地，以上列出的免疫配體包含能夠被糖基化和/或與Fc受體（例如Fc γ RI ( CD64)，F(xiàn)e γ RIIA (CD32)，F(xiàn)e γ RIIB (CD32)，F(xiàn)e γ RIIIA (CD16a)，F(xiàn)e γ RIIIB (CD16b))結(jié)合的 Fe區(qū)域或另一種結(jié)構(gòu)域。
[0054] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體（mAb) "應(yīng)意指具有同質(zhì)抗體群體（即，由完整 的免疫球蛋白或其片段或衍生物組成的同質(zhì)群體）的抗體組成物。特別優(yōu)選的，這樣的抗 體選自IgG、IgD、IgE、IgA和/或IgM、或其片段或衍生物。
[0055] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"衍生物"應(yīng)意指與一般抗體槪念結(jié)構(gòu)上不同但仍具有某些結(jié) 構(gòu)關(guān)系的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。
[0056] 用于產(chǎn)生和/或選擇嵌合、人源化和/或人mAb的方法是本領(lǐng)域已知的。例如， Genentech 的US6331415 描述嵌合抗體的產(chǎn)生，而Medical Research Council 的US6548640 描述⑶R移植技術(shù)，以及Celltech的US5859205描述人源化抗體的產(chǎn)生。除其它以外，體 外抗體文庫(kù)公開(kāi)于 MorphoSys 的 US6300064 以及 MRC/Scripps/Stratagene 的 US6248516 中。噬菌體展示技術(shù)例如被公開(kāi)于Dyax的US5223409中。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物平臺(tái)例如被描 述于 TaconicArtemis 的 US200302048621 中。
[0057] 術(shù)語(yǔ)"新抗體形式"包含例如雙特異性或三特異性抗體構(gòu)建體、雙體抗體、駱駝科 動(dòng)物抗體、域抗體、具有由scFvs組成的兩條鏈的雙價(jià)同二聚體、IgAs (通過(guò)J鏈和分泌性 成分連接的兩個(gè)IgG結(jié)構(gòu)）、鯊魚(yú)抗體、由新世界靈長(zhǎng)類動(dòng)物框架加上非新世界靈長(zhǎng)類動(dòng)物 CDR組成的抗體、包含CH3+VL+VH的二聚化構(gòu)建體以及抗體綴合物（例如，連接到毒素、細(xì)胞 因子、放射性同位素或標(biāo)記的抗體或片段或衍生物）。然而此列表不是限制性的。
[0058] 此外，該術(shù)語(yǔ)也包括免疫毒素（即，由抗體或其片段組成的雜二聚體分子），以及 細(xì)胞毒性、放射性及細(xì)胞凋亡因子。這樣的形式類型例如已由Philogen開(kāi)發(fā)（例如，與人 TNF融合的抗-EDB人抗體L19)或是由與細(xì)胞毒性的Mertansine (DMl)連接的曲妥珠單抗 組成的 Trastuzumab emtansine (T-DMl) ο
[0059] 術(shù)語(yǔ)"融合肽"或"融合蛋白"涉及例如由免疫球蛋白Fe部分加上靶結(jié)合部分組 成的蛋白質(zhì)（所謂的-C印t分子）。
[0060] 在根據(jù)本發(fā)明的方法或過(guò)程的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是，相較于在不存 在升高的錳或錳離子濃度的情況下表達(dá)的免疫配體，該免疫配體具有減少程度的巖藻糖基 化。
[0061] 優(yōu)選地，根據(jù)本領(lǐng)域的方法來(lái)測(cè)定巖藻糖基化程度。除其它以外，這樣的方法包括 用肽-N-糖苷酶F (PNGase F)消化以將抗體去糖基化（更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)圖1的描述），和隨后 收集分離出的聚糖。將收集到的聚糖用鄰氨基苯甲酸標(biāo)記，并且隨后藉由NP HPLC進(jìn)行分 析。該方法的全部細(xì)節(jié)公開(kāi)于Anumula(2012)，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
[0062] 術(shù)語(yǔ)"不存在升高的錳或錳離子濃度"是指在該過(guò)程期間或在該過(guò)程的準(zhǔn)備中，沒(méi) 有出于自愿地引入錳或錳離子。這并未排除仍可存在微量的錳，其天然存在于介質(zhì)（如水） 中。
[0063] 在根據(jù)本發(fā)明的方法或過(guò)程的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是，相較于（i)在不存在 升高的錳或錳離子濃度的情況下表達(dá)的或（ii)具有較高的巖藻糖基化程度的免疫配體， 該免疫配體顯示增加的ADCC活性。
[0064] 術(shù)語(yǔ)"ADCC"涉及細(xì)胞介導(dǎo)免疫防御的機(jī)制，藉此免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞主動(dòng)地裂解 靶細(xì)胞，其膜表面抗原已被特異性抗體結(jié)合。它是作為體液免疫反應(yīng)的一部分的抗體通過(guò) 其可以用來(lái)限制及遏制感染的多種機(jī)制中的一種。經(jīng)典的ADCC是由自然殺傷（NK)細(xì)胞介 導(dǎo)的；巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞也可以介導(dǎo)ADCC。由于其依賴于先前的抗 體反應(yīng)，所以ADCC是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的一部分。
[0065] 優(yōu)選地，通過(guò)根據(jù)本領(lǐng)域的方法來(lái)測(cè)定ADCC活性。除其它以外，這樣的方法包括 如圖3顯示的細(xì)胞毒性測(cè)定法。
[0066] 其它合適的測(cè)定法包括鉻-51 [Cr51]釋放測(cè)定法、銪[Eu]釋放測(cè)定法及 硫-35 [S35]釋放測(cè)定法。通常，表達(dá)某一表面暴露抗原的被標(biāo)記的靶細(xì)胞系與特異于該抗 原的抗體一起溫育。在洗滌后，表達(dá)Fc受體CD16的效應(yīng)細(xì)胞與抗體標(biāo)記的靶細(xì)胞共溫育。 隨后，以閃爍計(jì)數(shù)器或分光光度法通過(guò)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的釋放來(lái)測(cè)量靶細(xì)胞裂解。耦合的生物 發(fā)光方法aCella TOX現(xiàn)在普遍地用于ADCC及其它細(xì)胞毒性評(píng)估。由于此技術(shù)測(cè)量天然存 在于靶細(xì)胞中的酶的釋放，不需要標(biāo)記步驟并且不使用放射性試劑。
[0067] 優(yōu)選地，免疫配體靶向牽涉細(xì)胞介導(dǎo)免疫防御的一種或多種細(xì)胞表面抗原。
[0068] 優(yōu)選地，所述細(xì)胞表面抗原選自親環(huán)蛋白C、補(bǔ)體因子I、⑶6、⑶5、牛WC-I和M130。
[0069] ⑶6是主要由人T細(xì)胞及B細(xì)胞的子集以及由一些B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病 和神經(jīng)元表達(dá)的一種重要的細(xì)胞表面蛋白（Aruffo等人1991，Kantoun等人1981，Mayer等 人1990)。CD6是蛋白質(zhì)大家族的一員，特征在于具有與I型巨噬細(xì)胞的清道夫受體的富含 半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（SRCR)同源的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域（Matsumoto等人1991以及Resnick等人 1994)。此家族的其它成員包括⑶5 (Jones等人，1986)、親環(huán)蛋白C (Friedman等人1993)、 結(jié)合活化的補(bǔ)體蛋白C3b及C4b的補(bǔ)體因子I (Goldberger等人，J. Biol. Chem. 1987， 262:10065)、由.τ·/· δ · T 細(xì)胞表達(dá)的牛 WC-UWijingaard 等人 1992)以及 M130 (Law 等 人1993)，其是巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志物。
[0070] 其它優(yōu)選的表面抗原包括CD20、EGFR、HER2/neu以及膜結(jié)合的TNF。
[0071] 在根據(jù)本發(fā)明的方法或過(guò)程的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的免疫配體是Itolizumab。
[0072] Itolizumab (INN，商品名A丨ZUmab⑨）是由Biocon開(kāi)發(fā)的一種"全新"人源化 IgGl單克隆抗體。它選擇性地靶向CD6,其是牽涉T細(xì)胞的共同刺激、附著及成熟的泛T細(xì) 胞（pan T cell)標(biāo)志物。Itolizumab通過(guò)與⑶6結(jié)合下調(diào)T細(xì)胞活化，導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因 子合成的減少并且可能通過(guò)減少T細(xì)胞在炎癥位置的滲入作用而發(fā)揮重要的作用。相較于 安慰劑，itolizumab的雙盲