，將3 μ 1的SEB溶解于3ml的培養(yǎng)基，得到lmg/ml的SEB工作溶液。按照標準 方案，用0. 6ug的SEB處理0. 06xl06個DC。制得0. 1x10 6個細胞/毫升的貯存液（LPS處 理過的成熟DC)。由此，將600 μ 1的細胞懸浮物溶解于2. 4ml的測定培養(yǎng)基（細胞懸浮物 的總體積為包含〇. 02xl06個細胞/毫升的3ml)中。將其以1500rpm、5分鐘旋轉(zhuǎn)，并且將 600ml的SEB (lug/ml)加至沉淀物。將其在37°C下于C02培養(yǎng)箱內(nèi)溫育20分鐘。溫育后 將過量的培養(yǎng)基（2ml)加至試管內(nèi)，并且以1500rpm洗滌5分鐘。丟棄上清液，并且再次用 3ml的培養(yǎng)基洗滌細胞。最后將沉淀物溶解于3ml的測定培養(yǎng)基。
[0110] 對PBL進行絲裂霉素 C處理：從lmg/ml的絲裂霉素貯存液制得25 μ g/ml的絲裂 霉素溶液。在37°C下于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用500 μ 1的25 μ g/ml絲裂霉素對0. 5x10 6個PBL處 理30分鐘。溫育后，向其加入過量的培養(yǎng)基（2ml)，并在1500rpm下洗滌細胞5分鐘。丟棄 上清液，并且再次用3ml的培養(yǎng)基洗滌細胞。
[0111] MLR測定-增殖的抑制：以DC: PBL = 1:50的比例進行MLR測定。使用的陰性對 照是尼妥珠單抗。將天然的Tlh針對其缺少完整功能的Fc區(qū)域的Fab2形式進行測試。6 天后使用Bio-Tek Synergy HT Gen5讀板器利用阿拉瑪藍來讀取板。
[0112] 完整的抗體可以抑制在此反應(yīng)中誘發(fā)的T細胞增殖，而具有不同特異性的陰性對 照尼妥珠單抗則不能。沒有Fc區(qū)域的Tlh也無法抑制T細胞增殖，表明在此測定中糖基化 的Fc區(qū)域和Fab對Tlh的抑制能力是關(guān)鍵性的。在使用去糖基化的Tlh中也觀察到類似 的效應(yīng)，由此確認Tlh的效應(yīng)子功能需要糖基化。
[0113] 圖5a :比較不同免疫調(diào)節(jié)劑的另一混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR)實驗的結(jié)果
[0114] 實驗方案與圖4相同。其為混合淋巴細胞反應(yīng)。除了 4倍濃度的天然Tlh外，還 使用其它免疫抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑，亦即吡美莫司（Pim)、阿巴西普（Aba)及達利珠單抗 (Dac)被包括作為用于測定的陽性對照。尼妥珠單抗（hR3)用作陰性對照。
[0115] 事實證明，相較于與人EGFR結(jié)合的特同種型抗體尼妥珠單抗，Tlh能夠降低 混合性淋巴細胞反應(yīng)中誘導(dǎo)的T細胞增殖。由Tlh誘導(dǎo)的倍數(shù)降低可與由阿巴西普 (CTLA4-IgGlFc)、達利珠單抗（抗CD25)及吡美莫司（小分子，IL2抑制劑）誘導(dǎo)的倍數(shù)降 低相當。
[0116] 圖5b :顯示于圖5a中的實驗的分析。
[0117] 該分析涉及144小時（6天）混合性淋巴細胞反應(yīng)后來自培養(yǎng)物的細胞。B-、B++、 B+-和B-+為四個象限。這里，在6天后評估MLR的培養(yǎng)物中的細胞。雖然與其它抗體相 較，Tlh有好的抑制能力，但Tlh的途徑是不同的，因為在這里與使用其它分子的實驗不同， 在⑶4/⑶25活化的T細胞群中存在顯著減少。Tlh顯示出⑶25+、⑶4+以及⑶4+T細胞的 減少。這表明T細胞子集的選擇性耗盡。因此，雖然如圖5a所顯示，在MLR中通過Tlh的抑 制可與達利珠單抗、阿巴西普及吡美莫司的抑制相當，但僅Tlh顯示⑶25+、⑶4+以及⑶4+T 細胞的減少。
[0118] 圖6 :比較天然抗體和去糖基化抗體的細胞毒性測定的結(jié)果。
[0119] 圖3中的相同測定被用于（與陽性對照（抗-CD3)相比較）評估具有不同非巖藻 糖基化含量的抗體。顯示的數(shù)據(jù)是來自η = 4的獨立實驗的匯編。
[0120] 如本文其它處所描述地進行非巖藻糖基化（參見，例如圖11的描述）C3Itolizumab 的Fc區(qū)域的非巖藻糖基化增加顯示由該抗體相對于陽性對照抗體（抗人CD3)展示的ADCC 活性的線性增加。這證實了通過僅增加非巖藻糖基化的Fc聚糖含量使ItoHzumab更具細 胞毒性的能力。例如，為了將ADCC從相對于抗CD3的活性的20%增強到高于40%，抗體中 的非巖藻糖基化含量應(yīng)大于10%。
[0121] 如于下文討論的biacore數(shù)據(jù)所示，這樣的增加可通過與Fe YRIII更好的結(jié)合而 引起（其中Bmab 600以相較于Tlh的更好親和力來結(jié)合）。因此在抗體中增加非巖藻糖基 化種類可引起與Fc γ RIII的更好結(jié)合，并且這轉(zhuǎn)變?yōu)楦玫腁DCC功能活性。
[0122] 圖7 :比較Tlh和利妥昔單抗的⑶C測定的結(jié)果
[0123] 使用人T細胞淋巴瘤細胞系Hut78( ATCC? TIB-161?)來評估Tlh的CDC活 性。將11104個細胞與1(^8/1^、14 8/1^和0.0148/1^的各藥物稀釋液在37°(：、5%0)2 培養(yǎng)箱中溫育20分鐘。以1:10的最終濃度加入合并的正常人血清，并在37°C將細胞溫育 2小時。加入AlamarBlue? (Invitrogen)并在37°C將細胞溫育20至22小時。染料 被細胞的攝取和隨后它的降低被讀取為在530/590nm處的熒光。
[0124] 在測定中使用利妥昔單抗（一種靶向B細胞系（Daudi)上的CD20受體并引起補 體依賴性細胞毒性（⑶C)的抗⑶20)作為陽性對照，以顯示導(dǎo)致⑶C的血清組分是完整的。
[0125] Tlh未顯示⑶C活性。Itolizumab的非巖藻糖基化種類的增加沒有增加該分子的 CDC活性，從而得出結(jié)論為只有ADCC效應(yīng)子功能隨著非巖藻糖基化的增加而增強。
[0126] 表1 :圖6和7所示的測定中使用的差別非巖藻糖基化Tlh樣品的聚糖特征譜。
[0128] 用標準方法進行糖基化模式的分析。簡言之，用肽-N-糖苷酶F (PNGase F)消化 抗體，以使抗體去糖基化（對于更多細節(jié)參見圖1的描述），并且收集分離的聚糖。將收集 到的聚糖用鄰氨基苯甲酸標記，并且隨后藉由NP HPLC進行分析。該方法的全部細節(jié)公開 于Anumula(2012)，其內(nèi)容通過引用并入本文。
[0129] 在此表中，使用了以下的縮寫：G0 =沒有半乳糖，Gl = 1個末端半乳糖殘基，G2 = 2個末端半乳糖殘基，GN = N-乙酰基葡糖胺或GlcNac，F(xiàn) =巖藻糖，Man5 = 5個甘露糖殘 基，Man6 = 6個甘露糖殘基以及S =唾液酸。
[0130] 在圖15中提供了在本文所示的實驗過程中所測定的糖基化模式的說明以及所使 用的命名法。
[0131] 圖8至圖10 :用等離子體共振檢測Tlh對Fcy RIIIa的結(jié)合曲線。
[0132] BIAcore是一種分析裝置，其檢測接近傳感器表面的基于表面等離子體共振的折 射率變化的差異。測定抗體針對Fc受體配體的親和力常數(shù)的此方法已被廣泛使用。為了檢 測相互作用，將一個分子（配體）固定在傳感器表面上。將它的結(jié)合配偶體（分析物）通 過流動池以及在連續(xù)的流動下注入到水溶液（樣品緩沖液）中。當分析物與配體結(jié)合時， 蛋白質(zhì)在表面上的累積導(dǎo)致了折射率的增加，其對時間作圖以產(chǎn)生感應(yīng)圖。從感應(yīng)圖的分 析測定締合常數(shù)（K a)、解離速率常數(shù)（Kd)及平衡解離常數(shù)（Kd)。
[0133] Fe γ RIIIa被認為是一種中間型親和受體。它可以變化地結(jié)合單體IgG并且似乎 與較低親和力Fcy受體相比具有對IgG的高親和力。它們在NK細胞和血液細胞的單核細 胞上表達。
[0134] 因為翻譯后修飾，特別是非巖藻糖基化模式隨細胞系和培養(yǎng)條件而變化， Bmab-600和Tlh的Fe部分以不同的親和力結(jié)合至Fe γ RIIla。我們在Biacore儀器中評估 這兩種產(chǎn)物針對Fe γ RIIIa的結(jié)合親和力。相較于Tlh，Bmab-600的結(jié)合親和力結(jié)果顯示 與Fey RIIIa受體結(jié)合的更高親和力。在固定有Fey RIIIa受體的表面上分析以下樣品：
[0135] I. Tlh 抗體
[0136] 2. Bmab-600 抗體
[0137] 3.去糖基化Tlh抗體
[0138] 每一樣品分析兩次并報告平均KdUM)值并且彼此比較。圖8顯示Tlh抗體對 Fe γ RIIIa的結(jié)合曲線，圖9顯示Bmab-600抗體對Fe γ RIIIa的結(jié)合曲線，以及圖10顯示 去糖基化Tlh抗體對Fe γ RIIIa的結(jié)合曲線。
[0139] 該方法是靈敏的并且能夠區(qū)分固有地存在于Bmab-600和Tlh的差異非巖藻糖基 化樣品中的非巖藻糖基化差異之間的不同。該數(shù)據(jù)還顯示，隨著非巖藻糖基化水平增加， Fe γ RIIIa結(jié)合親和力值成比例地降低（意味更高的親和力）。還通過在沒有觀察到結(jié)合 相互作用時分析Tlh的去糖基化樣品證實該方法的特異性。
[0Μ0] 表2 :Tlh抗體對Fe γ RIIIa的動力學(xué)值（參見圖8)
[0142] 表3 :Bmab600抗體對Fe γ RIIIa的速率常數(shù)值（參見圖9)
[0144] 表4 :去糖基化Tlh抗體對Fe γ RIIIa的速率常數(shù)值（參見圖10)
[0145]
[0146] 表5:Bmab-600和Tlh抗體對Fe γ RIIIa的差異非巖藻糖基化樣品的速率常數(shù)值 (參見圖10)
[0148] 圖11 :通過加入錳（Mn)引起的非巖藻糖基化
[0149] 針對產(chǎn)生Tlh單克隆抗體的CHO-S細胞系測試加入濃度高于培養(yǎng)基濃度 (0. 005 μΜ)的Μη。試驗以80萬至90萬個細胞/毫升的起始細胞數(shù)開始。在過程期間進 行葡萄糖和氨基酸的常規(guī)進料，以滿足細胞的營養(yǎng)需求。對樣品進行定期取樣以檢驗細胞 生長、存活力及IgG滴度特征譜。在培養(yǎng)結(jié)束時收獲培養(yǎng)基并且如本文別處描述地分析糖 基化特征譜。
[0150] 以兩組來完成試驗。第一組是在振蕩瓶中進行，而第二組是在50L生物反應(yīng)器中 進行。將錳加入培養(yǎng)基中并且在運行期間以指定間隔通過進料加入。
[0151] 圖11顯示將錳加入