的、安慰劑對(duì)照的、III期治療-斑塊研究（phase III treat-Plaq study)在治療具有中度至嚴(yán)重銀肩病的患者12周后，成功地滿足了 PASI-75分（銀 肩病面積和嚴(yán)重指數(shù)）得分的顯著改善的預(yù)先指定主要終點(diǎn)。Biocon在2013年1月從 印度藥品管理總局（DCGI)收到了藥品銷售許可，并且在2013年8月在印度境內(nèi)開(kāi)始銷售 (Jayaraman，2013)〇
[0073] 從小鼠衍生的NSO細(xì)胞系（本文稱做"Tlh"）并且還從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞 系（本文稱做"Bmab-600"）產(chǎn)生Itolizumab。因?yàn)榉g后修飾，特別是非巖藻糖基化模式 隨著細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而變化，Bmab-600及Tlh的Fc部分以不同的親和力與Fc γ RIIIa結(jié) 合。
[0074] 可以例如從小鼠衍生的NSO細(xì)胞系（本文稱做"Tlh"）并且還從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞系（本文稱做"Bmab-600"）產(chǎn)生Itolizumab。因?yàn)榉g后修飾，特別是非巖藻 糖基化模式隨著細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而變化，Bmab-600及Tlh的Fc部分以不同的親和力與 Fcy RIIIa 結(jié)合。
[0075] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種糖蛋白，所述糖蛋白用根據(jù)本發(fā)明的任何方 法或過(guò)程的方法或過(guò)程來(lái)產(chǎn)生。
[0076] 優(yōu)選地，所述糖蛋白是重組蛋白。更優(yōu)選地，所述糖蛋白是免疫配體，優(yōu)選是抗體。 特別優(yōu)選的是，所述糖蛋白在其糖基化模式上具有減少的巖藻糖含量。
[0077] 優(yōu)選地，糖蛋白或其子結(jié)構(gòu)域（如Fc區(qū)域）具有約35%的非巖藻糖基化水平。
[0078] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是，糖蛋白具有增加的ADCC。優(yōu)選地，所述糖蛋白是 Itolizumab0
[0079] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的是，糖蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)于CD25和CD4呈陽(yáng)性的細(xì)胞 特別是CD4+T細(xì)胞在體外或體內(nèi)的減少。
[0080] 本發(fā)明人出人意料地顯示，根據(jù)本發(fā)明的抗CD6抗體的使用導(dǎo)致對(duì)于表面抗原 CD25和CD4(參見(jiàn)圖5b及描述）呈成陽(yáng)性的細(xì)胞特別是CD4+T細(xì)胞的增殖減少。
[0081] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞的減少"意指（i)增殖的抑制、（ii)耗盡、（iii)細(xì)胞 凋亡的誘發(fā)或（iv)導(dǎo)致這樣的細(xì)胞的減少的其它機(jī)制。
[0082] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了如上所示的糖蛋白用于制造治療人或動(dòng)物患者的 藥物的用途。同樣地，提供了如上所示的糖蛋白用于治療人或動(dòng)物患者的用途。
[0083] 在這樣的用途的優(yōu)選實(shí)施方案中，人或動(dòng)物患者患有選自以下的疾病或已被診斷 為處于發(fā)生選自以下的疾病的風(fēng)險(xiǎn)中：
[0084] ?腫瘤疾病，包括腫瘤、淋巴瘤及白血病，特別是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病 (B-CLL)，特別是T細(xì)胞白血病
[0085] ?自身免疫疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀肩病、克羅恩氏病、紅斑狼瘡和/或舍格 倫病
[0086] ?神經(jīng)退行性疾病，包括多發(fā)性硬化和/或帕金森氏病、阿爾茨海默病、亨廷頓病 和/或肌萎縮側(cè)索硬化，和/或
[0087] ?感染性疾病
[0088] 優(yōu)選地，這樣的用途涉及治療或預(yù)防已進(jìn)行移植的人或動(dòng)物中的不良反應(yīng)如移植 物抗宿主病（GVHD)。這樣的移植包括器官移植以及骨髓移植。
[0089] 實(shí)驗(yàn)和附圖/實(shí)施例
[0090] 雖然已在附圖以及前文描述中詳細(xì)說(shuō)明及描述本發(fā)明，但這樣的說(shuō)明及描述應(yīng)被 認(rèn)為是示例性或范例性的且不是限制性的；本發(fā)明并不受限于所公開(kāi)的實(shí)施方案。本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員在實(shí)施請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明中可以通過(guò)研讀附圖、公開(kāi)內(nèi)容及所附權(quán)利要求書(shū)而 理解并實(shí)現(xiàn)對(duì)公開(kāi)的實(shí)施方案的其它變化。在權(quán)利要求書(shū)中，單詞"包含"未排除其它元素 或步驟，而且不定冠詞"一個(gè)"或"一種"并未排除復(fù)數(shù)。僅某些措施記載于互相不同的從 屬權(quán)利要求中的事實(shí)并非表明不能使用這些措施的組合以處于優(yōu)勢(shì)。權(quán)利要求中的任何參 考記號(hào)不應(yīng)被解釋為限制范圍。
[0091] 圖1 :用具有Fc區(qū)域的抗體進(jìn)行的去糖基化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0092] 將抗⑶抗體Itolizumab (也稱做Tlh)用去糖基化緩沖液（50mM Tris，ImM CaC12, pH = 8. 1)以對(duì)于Itolizumab(5mg/ml) 1:1的比例進(jìn)行溫育，隨后用肽-N-糖苷酶 F(PNGase)酶（對(duì)于Img抗體為10U)溫育24小時(shí)。
[0093] 在37°C下溫育24小時(shí)后，在樣品中加入相等體積的Tlh緩沖液（組氨酸海藻糖緩 沖液）并且在4°C、4000rpm于centricon管（50kD截?cái)噙^(guò)濾器）中離心15分鐘。將殘留 體積再次以相等體積的Tlh緩沖液重新懸浮，并在4°C、4000rpm下離心15分鐘。將去糖基 化的Ab儲(chǔ)存于最終的儲(chǔ)存管中，并通過(guò)Nano drop估計(jì)濃度。通過(guò)CE-SDS (毛細(xì)管電泳） 確認(rèn)去糖基化。隨后進(jìn)行熒光活化細(xì)胞分選儀（FACS)分析。簡(jiǎn)言之，用抗CD6抗體Tlh或 如上所述產(chǎn)生的去糖基化的Tlh抗體標(biāo)記HUT78細(xì)胞（T細(xì)胞系）。
[0094] 隨后使用FITC標(biāo)記的抗Fc的第二抗體，觀察到信號(hào)。圖1顯示Thl的Fc區(qū)域的 去糖基化并未損及其與表達(dá)CD6的細(xì)胞系結(jié)合的能力。這些結(jié)果進(jìn)一步由等離子體共振實(shí) 驗(yàn)確認(rèn)。
[0095] 圖2 :使用具有Fc區(qū)域的抗體進(jìn)行的去糖基化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0096] 具體地，如上文所討論的，將抗⑶抗體Itolizumab去糖基化。其抑制活化的T細(xì) 胞增殖的能力隨后在合適的增殖測(cè)定法中與未經(jīng)修飾的Tlh的能力進(jìn)行比較。使用尼妥珠 單抗作為陰性對(duì)照，尼妥珠單抗是具有與Itolizumab相同的IgG骨架但與EGFR結(jié)合的抗 體。
[0097] 簡(jiǎn)言之，使用碳酸氫鹽緩沖液（pH 9. 5)將抗體以0至1 μ g/ml范圍的濃度涂布在 無(wú)菌的96孔板中過(guò)夜。在洗滌后，將來(lái)自正常健康志愿者的純化淋巴細(xì)胞加至板中。加入 從80至lμg/ml的Itolizumab，并且將培養(yǎng)物溫育4天。加入阿拉瑪藍(lán)以測(cè)量增殖。相 對(duì)于未受刺激的細(xì)胞對(duì)照來(lái)計(jì)算倍數(shù)差異。使用同種型尼妥珠單抗抗體作為對(duì)照。附著在 板上的抗CD3 (所使用的抗CD3是在古巴分子免疫學(xué)中心制造的0KT3克?。┐碳?lái)自正常 健康的志愿者的幼稚T細(xì)胞（來(lái)自在Ficoll密度梯度上純化的人供體的外周血單核細(xì)胞 (PBMC))的增殖。
[0098] 尼妥珠單抗（80 μ g/ml)不顯示任何的T-細(xì)胞增殖抑制，與未受刺激的細(xì)胞相比， 導(dǎo)致了大約2. 75倍的細(xì)胞增加，而天然的Tlh顯示T-細(xì)胞增殖的抑制（在80 μ g/ml至 1. 25 μ g/ml的范圍為35至20%抑制）。與此相反，去糖基化的Tlh的影響與尼妥珠單抗的 影響類似。這意味著，在去糖基化后，抗體失去其抑制T細(xì)胞增殖的能力。
[0099] 圖3 :比較天然抗體和去糖基化抗體的細(xì)胞毒性測(cè)定法的結(jié)果
[0100] 將冷凍的PBMC于具有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中在IL-2 (濃度2. 5ng/mL)的 存在下解凍，并于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育過(guò)夜。第二天，將細(xì)胞重新懸浮于沒(méi)有IL-2的 培養(yǎng)基中并溫育4至5小時(shí)。將12, 000個(gè)Hut-78細(xì)胞/50 μ L加入96孔板中的每一孔。按 照模板加入50 μ L的3Χ濃縮藥物（10微克/毫升的天然的Tlh、去糖基化的Tlh或抗⑶3) 并于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育2小時(shí)。將PBMC重新懸浮于測(cè)定培養(yǎng)基中并加入240, 000 個(gè)PBMC/50 μ!7孔，以獲得1:20的靶對(duì)效應(yīng)物的比例。將板于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育 22小時(shí)。將50 μ L的Cyto Tox-Glo加至板并且于室溫溫育30分鐘。使用Spectramax來(lái) 讀取板的發(fā)光，以測(cè)定細(xì)胞毒性。
[0101] 雖然天然的Tlh相較于抗CD3(其為靶向T細(xì)胞的部分耗盡抗體）顯示輕微的但 統(tǒng)計(jì)上一致性的抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)活性，但該ADCC活性在分子的去糖基化后顯 著地降低，表明了 Tlh的效應(yīng)子功能。使用Itolizumab的Fab2片段也可以可與去糖基化 分子相當(dāng)?shù)亟档虯DCC活性。
[0102] 圖4 :比較天然的抗體和去糖基化的抗體的混合性淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)實(shí)驗(yàn)的結(jié) 果。
[0103] PBMC的制備：從健康供體收集30ml的血液。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)FICOLL密度梯度離心來(lái)分 離 PBMC0
[0104] 單核細(xì)胞耗盡及建立
[0105] 樹(shù)突細(xì)胞（DC)衍生測(cè)定：將這些細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱中溫育2小時(shí)。使單核細(xì)胞附 著在塑料表面上。隨后將未附著的細(xì)胞（PBL)從培養(yǎng)瓶移除。用IXPBS洗滌所有的培養(yǎng)瓶 一次。將20ml的DC培養(yǎng)基（制成50ml貯存液，在50ml的測(cè)定培養(yǎng)基中的10 μ 1粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GMCSF)和5 μ 1的IL-4)加至每一培養(yǎng)瓶。將培養(yǎng)瓶保持在0)2培 養(yǎng)箱中6天。
[0106] 對(duì)生長(zhǎng)中的樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行LPS處理：在第6天，將具有脂多糖（LPS)的DC培養(yǎng)基 加入每一培養(yǎng)瓶（在培養(yǎng)瓶中的LPS最終濃度為4ug/ml)并且放回C02培養(yǎng)箱中40至48 小時(shí)。
[0107] DC的制備：在LPS處理后，從兩個(gè)培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞懸浮物（DC)。用IXPBS洗滌每 一培養(yǎng)瓶一次。以1500rpm、5分鐘轉(zhuǎn)下細(xì)胞懸浮物，并且于3ml培養(yǎng)基中重建。計(jì)數(shù)LPS 處理過(guò)的DC，并且按照測(cè)定要求在培養(yǎng)基中重建。
[0108] PBL的制備：采用如前文所述的相同方案，在從另一健康個(gè)體收集血液后，進(jìn)行 Ficoll分離。在單核細(xì)胞耗盡之后，收集未附著的外周血淋巴細(xì)胞（PBL)并以1500rpm、5 分鐘轉(zhuǎn)下并在5ml培養(yǎng)基中重建。計(jì)數(shù)PBL并重建至1.0 xlO6個(gè)細(xì)胞/毫升。
[0109] 對(duì)樹(shù)突細(xì)胞（DC)進(jìn)行SEB處理：葡萄球菌腸毒素 B(SEB)貯存液濃度為lmg/ml。 從貯存液中