生產(chǎn)多肽的方法
【專利說明】生產(chǎn)多肽的方法 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及多肽生產(chǎn)領域，特別是在宿主細胞中生產(chǎn)重組多肽，所述宿主細胞生 產(chǎn)包涵體中的重組多肽。
【背景技術】
[0002] 在宿主細胞中表達重組多肽是生物技術和制藥工業(yè)中廣泛應用的標準技術。特別 地，通常使用微生物宿主，例如大腸桿菌（E. coli)，這是由于相對簡單的表達系統(tǒng)和細胞培 養(yǎng)條件可用于這些宿主細胞。因此，培養(yǎng)過程通常相當更經(jīng)濟。
[0003] 但是，在微生物細胞中進行表達時，經(jīng)常難于以可溶并具有活性的形式得到感興 趣多肽。經(jīng)常，重組多肽的表達導致產(chǎn)生變性形式的多肽的難溶的細胞內(nèi)聚集物，即所謂 的包涵體[Baneyx，F(xiàn).和 Mujacic，M. (2004) Nat. Biotechnol. 22,1399-1408 和 Sorensen， Η·Ρ·和 Mortensen，K.K. (2005)Microb.Cell Fact.4，l]，也稱之為經(jīng)典包涵體。
[0004] 經(jīng)典包涵體通常容易分離，典型地可以通過中速離心分離。為了從包涵體重新 獲得具備活性，即正確折疊，的多肽，包涵體必須進行溶解并在分離后將蛋白質(zhì)復性。一 些專利申請和專利涉及溶解包涵體和將從包涵體中獲得的蛋白質(zhì)復性。例如EP0512097、 EP0364926、EP0219874、W001/87925、Rudolph 1996、Rudolph 1990、Marston 1986 和 Dietrich 2003描述了關于變性蛋白的溶解和復性的通用技術。例如，EP0219874公開了重 新折疊來自大腸桿菌包涵體的重組蛋白的通用方法。為了溶解，在高PH環(huán)境下使用促溶劑 GuHCl和精氨酸。EP0219874描述了在GSH/GSSG提供的氧化還原條件下形成二硫橋。
[0005] 盡管已經(jīng)知道分離和溶解包涵體的許多方法，但結(jié)果總是不夠令人滿意。一個主 要問題在于包涵體的結(jié)構(gòu)可以改變。已經(jīng)知道細胞培養(yǎng)過程的參數(shù)，包括例如培養(yǎng)液的組 成，生長溫度和生產(chǎn)速率，可以影響包涵體的形成和結(jié)構(gòu)。W02004/015124描述了通過調(diào)整 培養(yǎng)條件形成"非經(jīng)典"包涵體。
[0006] 從包涵體獲得重組蛋白，特別是獲得具有活性的并且足夠量的重組蛋白，是不確 定的。有時，包涵體的結(jié)構(gòu)太"柔軟"導致難于用離心分離包涵體的情況。另一方面，包涵 體也有可能太"緊湊"。這會導致包涵體不能溶解，即使是在很苛刻的條件下。
[0007] 為了克服這些缺點，本發(fā)明提供新的細胞培養(yǎng)方法，該方法可以從包涵體中獲得 大量正確折疊的蛋白質(zhì)，所述包涵體可以容易地分離和溶解，從而提高重組蛋白的產(chǎn)量。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)多肽的領域，特別是在宿主細胞中生產(chǎn)重組多肽，所述宿主細胞 生產(chǎn)包涵體中的重組多肽。本發(fā)明提供從包涵體生產(chǎn)重組多肽的新方法，所述方法提高了 活性蛋白的產(chǎn)量。本文中，發(fā)明人證明了細胞培養(yǎng)條件的調(diào)整對活性形式的重組多肽的產(chǎn) 量有積極影響。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，包括較高的第一培養(yǎng)溫度和較低的第二培養(yǎng)溫度的兩步 培養(yǎng)法是有益的。本文描述的其他培養(yǎng)參數(shù)對細胞的生長和微生物宿主細胞中重組多肽的 表達也有積極影響。
[0010] 一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包涵體中的重組多肽的方法，所述方法包括
[0011] (a)在第一溫度培養(yǎng)一種微生物宿主細胞，該宿主細胞包含編碼所述重組多肽的 核酸，
[0012] (b)將培養(yǎng)溫度從所述第一溫度降低到第二溫度，和
[0013] (C)在第二溫度培養(yǎng)所述微生物宿主細胞。
[0014] 所述微生物宿主細胞可以是大腸桿菌細胞。所述第一溫度可以在36°C和38°C之 間，優(yōu)選37 °C。所述第二溫度可以在25 °C和36 °C之間，更優(yōu)選30 °C和36 °C之間，更優(yōu)選 32°C和35°C之間。在所述第一溫度和/或第二溫度培養(yǎng)期間的pH可以在6和8之間，優(yōu)選 6. 8和7. 2之間。
[0015] 在一些實施方案中，當細胞培養(yǎng)液的600nm光密度到達10和50之，更優(yōu)選27和 33之間時，降低溫度。
[0016] 在一些實施方案中，所述重組多肽是四螺旋束多肽。所述重組多肽可以是G-CSF。 在一些實施方案中，該G-CSF是人或牛G-CSF，任選地，在-1位置分別具有起始蛋氨酸殘基。
[0017] 在一些實施方案中，所述核酸與誘導型啟動子可操作連接。所述核酸可以包含在 載體中，例如表達載體。在一些實施方案中，在步驟（a)至（c)之前是講表達載體導入宿主 細胞的步驟，所述表達載體包含編碼所述重組多肽的核酸，其中所述核酸與誘導型啟動子 可操作連接。
[0018] 所述誘導型啟動子可以是T7啟動子。所述微生物宿主細胞的染色體可以包含編 碼噬菌體RNA聚合酶的核酸序列，任選地，所述核酸序列與Iac啟動子可操作連接，并且所 述微生物宿主細胞可以不含溶源性噬菌體核酸序列。所述噬菌體RNA酶可以是T7聚合酶。
[0019] 在一些實施方案中，重組多肽的表達是通過加入誘導物進行的?？梢栽诮档蜏囟?的同時或之后加入誘導物。所述誘導物可以是IPTG。
[0020] 再優(yōu)選的實施方案中，所述載體包含SEQ ID NO :4的序列。
[0021] 在一些實施方案中，編碼所述重組多肽的核酸選自：（i)編碼SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :1的多肽的核酸序列，或（ii)編碼與SEQ ID NO :3所描述的序列具有至少90%序列 相同性的多肽的核酸序列。
[0022] 附圖和表格的簡要說明
[0023] 表1 :來自不同第二培養(yǎng)溫度的細胞培養(yǎng)物的G-CSF產(chǎn)量。
[0024] 表2 :用于包括兩個重新折疊步驟的下游處理的優(yōu)選條件列表。
[0025] 表3 :三個起始于650g洗滌過且冷凍的包涵體的生產(chǎn)批次的純度和產(chǎn)量。產(chǎn)量的 計算涉及包涵體的濕重。
[0026] 表4 :總純度值和所選的兩種在G-CSF純化過程中與方法相關的雜質(zhì)（肌氨酰，內(nèi) 毒素）的值。范圍表明使用不同分析方法對三次G-CSF生產(chǎn)進行分析的結(jié)果。
[0027] 表5 :三次G-CSF生產(chǎn)的純度和活性。
[0028] 圖I :A，實施例1的表達載體的概述圖；B，G-CSF表達載體的序列，SEQ ID NO :4
[0029] 圖2 :SEC-HPLC色譜圖，其分析了作為參照的商業(yè)上可得的非格司亭藥物產(chǎn)品的 純度（3A)和按本文描述純化的產(chǎn)品的純度。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 本發(fā)明提供一種生產(chǎn)重組多肽的方法，該多肽在宿主細胞中以包涵體表達。編碼 該重組多肽的核酸被導入至宿主細胞中。然后培養(yǎng)所述宿主細胞以表達該重組多肽，其中 所述宿主細胞形成含有所述重組蛋白的包涵體。第一培養(yǎng)階段之后以及在連續(xù)的培養(yǎng)中， 培養(yǎng)溫度從較高溫度改變至較低溫度。然后在所述較低溫度繼續(xù)宿主細胞的培養(yǎng)。
[0032] 發(fā)明人在本文中證明細胞培養(yǎng)條件的調(diào)整對活性形式的重組多肽的產(chǎn)量有積極 影響。發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)在宿主細胞的培養(yǎng)過程中降低細胞培養(yǎng)溫度導致重組蛋白的產(chǎn) 量提高。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，其他參數(shù)，例如導入模式、PH、下游處理、和特別是表達系統(tǒng)的選擇 等，也可以對產(chǎn)量發(fā)揮積極作用。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明描述的優(yōu)選的溫度和優(yōu)選的表達系統(tǒng)的組合 是特別有益的。
[0033] 盡管未見于任何理論，發(fā)明人相信本文描述的培養(yǎng)溫度的調(diào)整優(yōu)化了包涵體的結(jié) 構(gòu)，增加了包涵體中正確折疊的蛋白質(zhì)的量，從而有利于更多來自包涵體的具有活性的重 組蛋白復性。發(fā)明人相信包涵體的結(jié)構(gòu)和組成可以是關于復性的有活性的多肽產(chǎn)量的限制 性因素。本文描述的其它參數(shù)，例如導入模式、pH、下游處理和特別是表達系統(tǒng)，更加有利于 產(chǎn)量的額外增加。本文描述的各種其他參數(shù)可以單獨應用或通過將一種或多種應用于本文 描述的方法而組合。本文描述的方法可以改善細胞生長和微生物宿主細胞中重組多肽的表 達。
[0034] 本發(fā)明的第一方面，提供了生產(chǎn)以包涵體表達的重組多肽的方法，該方法包括以 下步驟（a)在第一溫度培養(yǎng)微生物宿主細胞，該宿主細胞包含編碼所述重組多肽的核酸， (b)將培養(yǎng)溫度從所述第一溫度降低到第二溫度，和（c)在所述第二溫度培養(yǎng)所述微生物 宿主細胞。在連續(xù)培養(yǎng)過程中降低溫度。將所述核酸導入宿主細胞。所述核酸可以包含于 載體中。所述核酸可以與誘導型啟動子連接。
[0035] 本文所使用的術語"多肽"和"蛋白質(zhì)"可以相互替換使用，用于描述一系列通過 肽鍵相互連接的氨基酸殘基。
[0036] "重組核酸"是核酸使用分子工程技術以創(chuàng)建遺傳材料的新組合，產(chǎn)生不會在生物 中另外找到的核酸而得到的核酸。在活細胞中表達重組核酸得到的蛋白質(zhì)稱為"重組蛋白" 或"重組多肽"。將編碼重組蛋白的重組核酸導入宿主細胞。本文方法中使用的"核酸"可 以是外源核酸，即，核酸對于該宿主細胞是外來的。或者所述核酸可以來源于該宿主，并可 以編碼所述宿主自然表達的多肽。例如，導入第二個拷貝可以導致增加的表達。或者將所 述核酸序列置于發(fā)現(xiàn)的用于宿主細胞該核酸的天然轉(zhuǎn)錄控制之外的轉(zhuǎn)錄控制下。從而重組 形式的所述蛋白質(zhì)以不同的表達水平表達，例如其相對其內(nèi)源表達水平可能過表達或低水 平表達。
[0037] 在導入宿主細胞前，編碼感興趣蛋白的重組核酸序列可以通過一個或多個突變、 插入、刪除和/或替換進行修飾，只要這種修飾的序列能夠編碼與所述目標蛋白具有相同 生物學功能的活性蛋白（即其是感興趣蛋白的功能等價物）。本文提及的重組核酸序列 還包括源自不同域（domain)(界（empire))的生物體，例如源自真核生物（真核生物來源 的），的核酸序列，例如人的序列，其已經(jīng)根據(jù)原核宿主的"密碼子使用"進行修飾以優(yōu)化在 宿主細胞中的表達。
[0038] 本發(fā)明可以應用于生產(chǎn)包涵體中的的任何蛋白質(zhì)。包涵體通常由相對疏水的蛋白 質(zhì)（例如G-CSF)形成，因此本發(fā)明可以容易地應用于相對疏水的蛋白質(zhì)，尤其是那些沒有 太多二硫鍵的蛋白質(zhì)（類似于G-CSF)。因此，本發(fā)明可能特別適于那些與G-CSF具有相同 性質(zhì)的蛋白質(zhì)，例如相似的溶解性，相似的疏水性，相似數(shù)目的半胱氨酸鍵等。在一些實施 方案中該方法用于疏水蛋白質(zhì)。
[0039] 特別地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所謂的"螺旋束蛋白"和特別是"四螺旋束蛋白"以本文描述 的方法表現(xiàn)出特別改善的高表達速率。所有螺旋束蛋白具有共同的核心結(jié)構(gòu)。在其二級 結(jié)構(gòu)中具有一些α螺旋，這些α螺旋通常在三級結(jié)構(gòu)中以相互平行或反平行構(gòu)造進行定 向。四螺旋束蛋白特別適合以本發(fā)明的方法進行生產(chǎn)。Ricci等于2003年和Weber等于 1980年描述了四螺旋束家族蛋白的共同結(jié)構(gòu)和成員。特別適合本發(fā)明的螺旋束蛋白的非限 制性實例包括G-CSF (粒細胞集落刺激性因子）、GM-CSF (粒細胞-巨噬細胞集落刺激性因 子）、M-CSF(巨噬細胞刺激性因子）、hGH(人類生長激素）、干擾素（例如IFN- α 2 (干擾素 α 2)或者β干擾素）、白細胞介素（例如IL-2(白細胞介素-2)、IL-4(白細胞介素-4)、 IL-7(白細胞介素-7)、或IL-9(白細胞介素-9))、促紅細胞生成素、瘦素、MGDF (巨核細胞 生長發(fā)育因子）和其他細胞因子。在優(yōu)選的實施方案中，所述重組多肽選自G-CSF、GM-CSF、 M-CSF、hGH、IFN-a 2、IL-2、IL-4、IL-7、和IL-9。在更優(yōu)選的實施方案中，所述重組多肽選 自 G-CSF，GM-CSF 和 M-CSF0
[0040] 編碼重組蛋白的核酸序列可以為了在微生物宿主細胞尤其是大腸桿菌中表達進 行密碼子優(yōu)化。
[0041] 在一些優(yōu)選的實施方案中，所述重組多肽是G-CSF。人類粒細胞集落刺激因子 (hG-CSF)屬于造血生長因子，其在中性粒細胞的形成中具有決定性作用。G-CSF用于血 液學和腫瘤學領域中的藥物。如今，市場上有兩種用于臨床使用的G-CSF形式：來格司 亭，其是糖基化的并產(chǎn)生于哺乳細胞中，尤其是CHO細胞系（Holloway CJ(1994)Eur J Cancer 30A Suppl 3 :S2-S6.，EP169566)，和非格司亭，其是非糖基化的并產(chǎn)生于大腸桿菌 (EP237545)。
[0042] 如本文所用，本發(fā)明上下文中的"G-CSF"包括G-CSF的物種直系同源物，例如人類 G-CSF，牛G-CSF等。人類G-CSF的氨基酸序列是（SEQ ID N0:1):
[0043] TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQ⑶GAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGTPWAPLSSCPSQAL QLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQR RAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP,
[0044] 這可以在例如Holloway，1994中或以藥物數(shù)據(jù)庫登陸號No DB00099找到。
[0045] 牛G-CSF的氨基酸序列是（SEQ ID NO :2):
[0046] TPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSL QLRGCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQR RAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP，
[0047] 其可以在例如US5849883的圖7中或以PDB登錄號No : IBGC-A找到。
[0048] 在一些優(yōu)選的實施方案中，所述G-CSF是哺乳動物G-CSF。在特別優(yōu)選的實施 方案中，所述多肽是人類G-CSF [藥品數(shù)據(jù)庫登錄號No :DB00099]，牛G-CSF [PDB登陸 號No :1BGC-A]，或者其功能性變體。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述重組多肽是蛋氨 酰-G-CSF(Met-G-CSF)，例如人類 Met-G-CSF(r-met-hu-G-CSF =非格司亭）。
[0049] 非格司亭的氨基酸序列是（SEQ ID NO :3):
[0050] MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQA LQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQ RRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP 〇
[0051] 還可以蛋氨酰-牛G-CSF的形式提供牛G-CSF。
[0052] 如本文所用，本發(fā)明上下文中的"G-CSF"包括G-CSF的功能性變體。本文提及的 "變體"指的是"功能性變體"，除非上下文另有說明。G-CSF蛋白的變體指的是不同于G-CSF 蛋白序列，但仍然具有相同的生物學活性的蛋白質(zhì)（功能性變體）。G-CSF蛋白的"變體"指 的是一個或多個氨基酸不同于參考G-CSF蛋白序列（例