其與誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子可操作地連接，優(yōu)選T7啟動(dòng)子。所述核酸的表達(dá)由誘導(dǎo)物的存在引發(fā)。如果使用T7啟 動(dòng)子，表達(dá)由DNA依賴的T7 RNA聚合酶引發(fā)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體可以包 含序列SEQ ID NO :4或由其組成。
[0079] 對(duì)應(yīng)于這樣的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可以含有合適的表達(dá)系統(tǒng)。例如所述微生物宿 主細(xì)胞的染色體可以包含噬菌體RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶的核酸。所述噬菌體RNA 聚合酶可以與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接，例如Iac啟動(dòng)子（IacZ蛋白β-半乳糖苷酶啟 動(dòng)子）。可以通過向宿主細(xì)胞添加IPTG(異丙基-1-硫-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）誘導(dǎo) Iac啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述微生物宿主細(xì)胞的染色體不含溶原性噬菌體核酸序列。發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)在本文描述的方法中使用這樣的表達(dá)系統(tǒng)/表達(dá)載體特別有益并導(dǎo)致從包涵體得到高 產(chǎn)量的重組蛋白。特別地，發(fā)明人這樣的表達(dá)系統(tǒng)/表達(dá)載體與本文描述的培養(yǎng)方法（即 (i)在第一溫度培養(yǎng)所述微生物宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含編碼所述重組蛋白的核酸，（ii) 將培養(yǎng)溫度從所述第一溫度降低到第二溫度，和（iii)在所述第二溫度培養(yǎng)微生物宿主細(xì) 胞聯(lián)合使用）是特別有益的。
[0080] 因此，本發(fā)明的一方面，提供了（在宿主細(xì)胞中）產(chǎn)生包涵體中的重組多肽的方 法，所述方法包括以下步驟：（i)將包含編碼重組多肽的核酸的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，其 中所述核酸與啟動(dòng)子（優(yōu)選誘導(dǎo)型啟動(dòng)子）可操作地連接，（ii)在第一溫度培養(yǎng)所述微生 物宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含編碼所述重組蛋白的核酸，（iii)將培養(yǎng)溫度從所述第一溫度 降低到第二溫度，和（iv)在所述第二溫度培養(yǎng)微生物宿主細(xì)胞。所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以是 17啟動(dòng)子。所述微生物宿主細(xì)胞的染色體可以包含編碼噬菌體RNA聚合酶的核酸序列，任 選地，所述核酸序列與例如Iac啟動(dòng)子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接，所述染色體并不含 溶原性噬菌體核酸序列。所述噬菌體RNA聚合酶可以是T7聚合酶。所述多肽的表達(dá)通過 添加誘導(dǎo)物（例如IPTG)進(jìn)行。
[0081] 驚人地，發(fā)現(xiàn)上述表達(dá)系統(tǒng)在本文描述的方法中運(yùn)行特別好。本領(lǐng)域中高溫誘導(dǎo) 是經(jīng)常描述為最常見的誘導(dǎo)機(jī)制。然而發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上述的T7驅(qū)動(dòng)的表達(dá)系統(tǒng)與本文描述 的二溫度培養(yǎng)方法聯(lián)合使用對(duì)以活性形式表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量有特別的改善。
[0082] 在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞的染色體包含編碼噬菌體RNA T7聚合酶的 核酸，其與Iac啟動(dòng)子可操作地連接，所述染色體不含溶原性噬菌體核酸序列。所述載體包 括編碼重組多肽的核酸，其中所述核酸與T7啟動(dòng)子可操作地連接?；谔砑覫PTG，Iac啟 動(dòng)子誘導(dǎo)T7聚合酶的表達(dá)，然后通過T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。
[0083] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在溫育過程的特定點(diǎn)添加誘導(dǎo)物，例如將培養(yǎng)溫度從第一溫度降低至 較低的第二溫度的同時(shí)或之后添加，進(jìn)一步地促進(jìn)從包涵體得到的重組蛋白的產(chǎn)量。可以 在將培養(yǎng)溫度從第一溫度降低至較低的第二溫度的同時(shí)或之后添加誘導(dǎo)物。換句話說，可 以在降低溫度的時(shí)間點(diǎn)添加誘導(dǎo)物，或稍后添加，即在第二溫度的第二培養(yǎng)時(shí)期。優(yōu)選地， 在降低溫度的時(shí)間點(diǎn)添加誘導(dǎo)物。
[0084] 將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞
[0085] 包含感興趣的重組多肽的表達(dá)載體可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì) 胞。
[0086] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化"，"轉(zhuǎn)化的"或"將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞"指的是這樣的過程，其中帶或不 帶隨同材料的細(xì)胞外核酸比如載體進(jìn)入宿主細(xì)胞。術(shù)語"轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"或"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"指的 是導(dǎo)入核酸并且從而具有該核酸的細(xì)胞或其子代。所述核酸可以被導(dǎo)入所述細(xì)胞，這樣所 述核酸無論作為染色體組成部分或染色體外元件都可以進(jìn)行復(fù)制?？梢允褂帽娝苤姆?法用例如表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，如顯微注射、電孔穿法、粒子轟擊或化學(xué)方法如磷 酸媽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其描述于例如Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory 或 Ausubel et al. ，1994， Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons。
[0087] 宿主細(xì)胞
[0088] 任何可以以包涵體表達(dá)重組蛋白的微生物細(xì)胞都可以在本發(fā)明中使用。產(chǎn)生重組 蛋白的包涵體的微生物細(xì)胞包括例如細(xì)菌和酵母細(xì)胞以及絲狀真菌細(xì)胞。所述"宿主細(xì)胞" 或"宿主"可以是任何微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌，酵母或絲狀真菌細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞是優(yōu)選的宿 主細(xì)胞，革蘭陰性菌是特別優(yōu)選的。實(shí)例包括細(xì)胞如C2523, C2523,和BL21 (DE3)(都來自 New England Biolabs)。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。合適的用于特定表達(dá)系統(tǒng) 的宿主細(xì)胞同樣如上所述。
[0089] 術(shù)語"宿主"、"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"在本文中是可以互換使用的，其指的 是導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)載體或分離純化的核酸序列的微生物細(xì)胞。本文使用的"宿主細(xì)胞"的 單數(shù)形式是指也可以使用細(xì)胞的復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有說明。實(shí)踐中，在重組的宿主細(xì) 胞的生產(chǎn)中，細(xì)胞培養(yǎng)中使用宿主細(xì)胞的復(fù)數(shù)形式。
[0090] 術(shù)語"分離純化的核酸序列"指的是所述核酸序列不含有或基本上不含有天然相 關(guān)的物質(zhì)（例如在自然環(huán)境中或制備的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的其他核酸）的狀態(tài)，，所述制備的環(huán)境 是指在體內(nèi)或體外用重組技術(shù)（例如細(xì)胞培養(yǎng)）進(jìn)行制備的環(huán)境。
[0091] 應(yīng)該了解術(shù)語"宿主"、"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"不僅指特定的受試細(xì)胞還 指這種細(xì)胞的子代或潛在子代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境的影響，后代可能會(huì)發(fā)生一些改變， 所以這些子代事實(shí)上有可能與親代細(xì)胞不相同，但只要它們產(chǎn)生重組蛋白或其功能性變體 (參見上面的功能性變體的討論）的活性形式，那么他們?nèi)匀话ㄔ诒疚氖褂玫男g(shù)語的范 圍內(nèi)。
[0092] 如果宿主來自原核種類，所述重組核酸序列可以來自不同的屬或科，來自不同的 目或綱，來自不同的門（類（division))或來自不同的域（界）的生物。
[0093] 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以冷凍并保存。可以制備主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)，并測(cè)試其活 性、同一性、純度和穩(wěn)定性。
[0094] 進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)條件
[0095] 已經(jīng)完善地建立了通常用于微生物細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)置（set up)和培養(yǎng)條件，在此僅 進(jìn)行簡(jiǎn)述。標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)將基于本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)知識(shí)做調(diào)整。
[0096] 細(xì)胞培養(yǎng)基上接種一份轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞樣品。本領(lǐng)域已知合適的培養(yǎng)基， 包括例如GBA培養(yǎng)基、SOC (超優(yōu)碳）培養(yǎng)基、LB (Luria)培養(yǎng)基或RBY培養(yǎng)基?？梢越臃N各 種量的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)可以是小規(guī)模培養(yǎng)例如用于實(shí)驗(yàn)室，例如Iml至IL的培養(yǎng)基。所 描述的方法對(duì)達(dá)到工業(yè)化規(guī)模（即制備型規(guī)模）的大體積也同樣是特別有用的。因此，本 文描述的方法可以使用更大的細(xì)胞培養(yǎng)體積進(jìn)行，包括用于工業(yè)用途的大規(guī)模處理。所述 培養(yǎng)可以在1-5L，或1-10L，或1-100L，或1-500L，或1-1000L或更多的范圍內(nèi)進(jìn)行。所述 培養(yǎng)可以在 5-5000L，或 10-5000L，或 50-5000L，或 100-5000L，或 5-1000L 或 10-1000L 或 50-1000L或100-1000L的范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0097] 在一些實(shí)施方案中，首先接種種子培養(yǎng)物。培養(yǎng)種子培養(yǎng)物直到達(dá)到特定的光密 度。培養(yǎng)種子培養(yǎng)物直到600nm的光密度在以下范圍之內(nèi)：0. 5和1. 5之間，或0. 6和1. 4 之間，或0.7和1.3之間，或0.8和1.2之間，或0.9和I. 1之間。優(yōu)選的光密度是在0.9 和I. 1之間的范圍內(nèi)。然后可以將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到有新鮮的培養(yǎng)基的更大的生物反應(yīng)器 中。
[0098] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，有必要監(jiān)控例如細(xì)胞培養(yǎng)中的溶解氧水平和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以保 證有效的細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0099] 補(bǔ)料速率可以是線性的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)溶解氧（DO)水平由于碳源的消耗 而開始從起始點(diǎn)迅速增加時(shí)，可以開始線性的補(bǔ)料添加。DO起始點(diǎn)可以在10%和50%之 間，20%和45%之間，30%和45%之間，35%和45%之間，37%和42%之間，或39%和40% 之間。所述 DO 可以是 35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%或 45%，或 DO可以是這些數(shù)值的兩個(gè)的任意組合。優(yōu)選地，所述DO是40%。
[0100] 合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。作為碳源，培養(yǎng)基中可以使用糖醇，優(yōu)選甘油。 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用甘油作為碳源得到了高的生長(zhǎng)速率和高的生物量。補(bǔ)料培養(yǎng)基中的成分可 以包括尤其是氨基酸（主要是L-蛋氨酸，L-谷氨酰胺和L-亮氨酸）和礦物質(zhì)（例如鹽類、 磷酸鹽、硫酸鹽）。所有使用的原料都是不含動(dòng)物成分的。
[0101] 可以使用一或多種消沫劑或選擇劑。PPG2000、JM633、SB2020可以作為消沫劑使 用。發(fā)酵培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含單硫酸卡那霉素（一種氨基糖苷類抗生素）作為選擇劑。
[0102] 基于所使用的實(shí)際宿主細(xì)胞，可以存在另外的成分。
[0103] 下游處理
[0104] "下游處理"包括進(jìn)一步處理從培養(yǎng)物得到的細(xì)胞。所述細(xì)胞含有具有重組蛋白的 包涵體。
[0105] 培養(yǎng)包含轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物以后，可以使用低速離心或分離器從培養(yǎng) 基分離細(xì)胞。細(xì)胞裂解后，得到含有重組蛋白的包涵體。在一些實(shí)施方案中，本文任何地方 描述的方法因此進(jìn)一步包括從宿主細(xì)胞得到包涵體的步驟。
[0106] 可以用標(biāo)準(zhǔn)方法得到包涵體。從宿主細(xì)胞得到包涵體的過程通常包括細(xì)胞裂解和 破碎然后離心。可以這樣得到包涵體：在分離器中收集細(xì)胞（例如約11 〇〇〇g，例如通過離 心），機(jī)械性破碎細(xì)胞，例如使用高壓勻漿器（例如約IOOObar)，然后在分離器中將包涵體 從細(xì)胞碎片分離（例如在約ll〇〇〇g，例如通過離心分離）。包含很大比例的經(jīng)典包涵體的 細(xì)胞沉淀通常使用合適的緩沖液（包括洗滌劑）洗滌。所述包涵體可以儲(chǔ)存在合適的緩沖 液中。合適的緩沖液可以是任何生物學(xué)上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽，檸檬酸鹽，乙酸鹽， 酒石酸鹽緩沖液或水。在-80°C所述包涵體可以在合適的緩沖液中儲(chǔ)存至少8個(gè)月或不經(jīng) 過儲(chǔ)存步驟進(jìn)一步進(jìn)行繁殖。
[0107] 對(duì)于G-CSF的分離，已經(jīng)報(bào)道，使用例如1 %脫氧膽酸鹽（Zsebo KM et al (1986) Immunobiology 172 :175-184. EP237545 ;US5849883)或添加了 0· 1 % 吐溫 80 的 I. OM NaCl 溶液（Gelunaite L et al (2000) J Chromatogr A904 :131-143)洗絳經(jīng)典包涵體是方便的。
[0108] 得到包涵體后，必須從所述包涵體溶解重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，本文任何地 方描述的方法因此進(jìn)一步包含以下步驟：（i)得到包涵體和（ii)從所述包涵體得到重組蛋 白。本發(fā)明還提供了通過本文所述的方法可獲得的重組蛋白或得到的重組蛋白。
[0109] 可以使用如上所述的常用技術(shù)獲得包涵體。為了從包涵體生產(chǎn)正確折疊的具有 生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，所述包涵體在天然條件下不能溶解于常見的緩沖液或基于水的液體 中，從細(xì)胞分離所述包涵體，洗滌并溶解，然后在體外進(jìn)行復(fù)性。
[0110] 可以使用常用技術(shù)從包涵體得到重組蛋白。例如，EP0219874公開了重新折疊來 自大腸桿菌包涵體的重組蛋白的通用方法。為了溶解，在高PH使用促溶劑GuHCl和精氨 酸。EP0219874描述了 GSH/GSSG提供的氧化還原條件下二硫鍵的生成。得到可溶性單體 G-CSF 的方法描述在 Zsebo 1986、TO87/01132、Devlin 1988、Holloway 1994、W001/04154、 US5055555 中。進(jìn)一步的方法描述在 TO89/10932、Lu 1992、Heidari 2001、Wingfield 1988、Kang 1998、W098/53072、Wang 2005、W001/87925、W02004/015124、W02004/001056、 W02006/097944、W02006/135176、EP1630173、EP1837346、Rao 2008、Khalilzadeh 2008、 W02008/096370、W02010/146599。
[0111] 例如W089/10932和EP0719860描述了從微生物中分離純化重組G-CSF的方法。 W089/10932和EP0719860中描述的方法包括裂解微生物和從可溶性蛋白物質(zhì)中分離含有 G-CSF的不溶性物質(zhì)；在增溶劑和氧化劑的存在下溶解并氧化G-CSF ;使用具有交聯(lián)的苯乙 烯-二乙烯苯聚合物基質(zhì)的DOWEX離子交換樹脂去除增溶劑；使G-CSF通過離子交換色譜； 以及回收純化的G-CSF。所述離子交換色譜可以先是陰離子交換色譜（AEX)然后是陽離子 交換色譜（CEX)?？梢允褂肎aulin勻漿器進(jìn)行細(xì)胞裂解，隨后離心來收集沉淀?？梢允褂?例如脫氧膽酸鹽或其他膽汁鹽或非離子型洗滌劑洗滌包涵體。所述增溶劑可以是肌氨酰， 所述氧化劑可以是硫酸銅?？梢允褂肈owex或其他離子交換樹脂進(jìn)行成批吸附來去除肌氨 酰。隨后的AEX和/或CEX色譜可以用于精制（polishing)。
[0112] 這樣的純化程序可以從包涵體獲得可溶的、單體的并正確折疊形式的G-CSF?？梢?使用離子交換色譜進(jìn)一步將該蛋白質(zhì)純化成僅單體且氧化的形式。聚集物、二聚體或其他 不正確折疊的蛋白質(zhì)將沉淀并留在濾器中和柱子上。G-CSF是具有生物學(xué)活性的正確折疊 的單體形式。
[0113] 因此可以假定此處描述的方法得到的單體的，可溶的G-CSF是正確折疊的從而具 有生物學(xué)活性。可以使用實(shí)施例13陳述的方法測(cè)試G-CSF的生物學(xué)活性。發(fā)明人還在本 文描述了新的創(chuàng)造性的下游處理方法，其可以與本文描述的上游細(xì)胞培養(yǎng)（發(fā)酵）方法組 合使用。其導(dǎo)致進(jìn)一步提高的正確折疊的重組蛋白的產(chǎn)量。所述下游處理方法包括以下步 驟：溶解重組蛋白，進(jìn)行氧化和第一重新折疊步驟，去除增溶劑并進(jìn)行第二重新折疊步驟。 特別地，本文描述的培養(yǎng)方法可以與從包涵體重新折疊重組蛋白的方法聯(lián)合進(jìn)行，包括：
[0114] a)在增溶劑存在下溶解重組蛋白；
[0115] b)進(jìn)行氧化和第一重新折疊步驟，包括在氧化劑和增溶劑存在下溫育所述重組蛋 白；
[0116] c)用離子交換樹脂吸附和/或離子交換色譜去除增溶劑，并任選地進(jìn)行酸沉淀； 和
[0117] d)進(jìn)行第二重新折疊步驟，包括在不含增溶劑下稀釋和溫育步驟（C)的重組蛋 白。
[0118] 可以從微生物，優(yōu)選大腸桿菌中得到包涵體。所述增溶劑可以是N-月桂酰肌氨 酸。所述氧化劑可以是CuSO 4?？梢栽诒萷H 7更高的pH值下進(jìn)行溶解。所述增溶劑可以 是約0. 5%至約1. 5%濃度的月桂酰肌氨酸。氧化和第一重新折疊步驟可以進(jìn)行至少2小 時(shí)。所述氧化和第一重新折疊步驟可以在氣流下且不冷卻的條件下進(jìn)行。所述氧化和第一 重新折疊步驟可以在pH值為約7-9和/或溫度