域完善的技術(shù)溶解、重新折疊并進(jìn)一步純化G-CSF。合 適的方法描述在例如US5849883中。
[0169] 結(jié)果
[0170] 表1介紹上述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的發(fā)酵結(jié)果，其中第一培養(yǎng)溫度是37°C，第二培養(yǎng) 溫度分別是 25 °C、30 °C、32 °C、35 °C 或 37 °C。
[0171] 結(jié)果清楚表明了培養(yǎng)期間降低溫度能夠增加可溶性G-CSF的產(chǎn)量。特別地，在 32°C和35°C之間的第二培養(yǎng)溫度溫育明顯地增加了產(chǎn)量。第二溫育溫度為32°C是特別有 效的。
[0172] 實(shí)施例2:發(fā)酵和表達(dá)
[0173] 用重組的大腸桿菌C2523 T7 pol pRG/GCSFa克?。ㄓ冒珿-CSF的表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化的大腸桿菌）生產(chǎn)G-CSF (非格司亭）。在無菌條件下，以0. 10-0. 15cm3的細(xì)胞懸浮液接 種準(zhǔn)備好的種子培養(yǎng)基，該細(xì)胞懸浮液來自解凍的保存在液氮中的工作細(xì)胞庫小瓶。接種 的種子培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)的搖床中37°C，185rpm溫育24-28小時(shí)。當(dāng)六個(gè)搖瓶培養(yǎng)物的600nm 光密度（OD)的平均值達(dá)到0.9-1. 1，將瓶中的內(nèi)容物收集到裝備有硅膠管的無菌的5dm3玻 璃瓶中。用WM323U/R泵將收集的3dm 3體積的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到IOOdm 3的發(fā)酵罐中，該發(fā) 酵罐裝有至多75dm3無菌的補(bǔ)充的生產(chǎn)培養(yǎng)基（GBA，使用甘油作為碳源的合成培養(yǎng)基）。在 37°C，嚴(yán)格的有氧條件下以浸沒培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基的碳源消耗完畢時(shí)，以合適的速率 向培養(yǎng)物添加甘油補(bǔ)料溶液。整個(gè)培養(yǎng)過程中溶解氧保持在不小于30%的水平。當(dāng)培養(yǎng)物 的OD值達(dá)到30,將溫度降低到32°C，并添加0. 33mM IPTG以誘導(dǎo)G-CSF的表達(dá)。進(jìn)一步培 養(yǎng)細(xì)菌5小時(shí)以生產(chǎn)G-CSF，直到OD為80-95。
[0174] 實(shí)施例3:細(xì)菌的收獲
[0175] 停止攪拌、通氣和碳源補(bǔ)料，冷卻培養(yǎng)物至低于15°C，然后通過在IlOOOg分離收 集細(xì)菌。細(xì)胞在轉(zhuǎn)子中沉淀，并用水洗出（排出）。收集細(xì)菌細(xì)胞的濃縮物并用水稀釋至 一半的體積，加入0.5M NaH2PO4，最終濃度為10mM。濕細(xì)菌細(xì)胞的總質(zhì)量（生物量）為約 10-11. 5kg〇
[0176] 實(shí)施例4 :細(xì)菌的裂解和包涵體的制備
[0177] 三次通過勻漿器以在壓力（IOOMPa)下將分離并洗滌過的細(xì)菌進(jìn)行破碎。通過在 分離器中在IlOOOg沉淀，將包涵體從細(xì)胞碎片分離。用洗滌緩沖液將沉淀的包涵體排出， 所述緩沖液包含5mM DTTUOmM NaH2P04、5mM EDTA和2%吐溫20，pH為7. 2。用相同的緩沖 液將濃縮的IB懸浮液稀釋2倍然后再次沉淀。使用IOmM NaH2POjl沖液重復(fù)該洗滌步驟 兩次，第二次洗滌結(jié)束時(shí)不稀釋。最后的IB沉淀物在-80°C冷凍儲(chǔ)存。
[0178] 實(shí)施例5:包涵體的溶解
[0179] 將冷凍的包涵體^50g濕重）解凍，并溶解于總體積為32. 5dm3的溶解緩沖液中， 該緩沖液含有40mM Tris-HCl和1% (w/v)N-月桂酰肌氨酸（肌氨酰），pH 8。在持續(xù)攪拌 下室溫溫育懸浮液。
[0180] 實(shí)施例6 :氧化性重新折疊（第一重新折疊）
[0181] 溶解的IB懸浮液用水稀釋兩倍，使得總體積65dm3的溶液中肌氨酰和Tris-HCl最 終濃度分別為0.5%和20mM。加入CuSO 4至最終濃度為40 μ M。在室溫進(jìn)行至少20小時(shí)的 連續(xù)攪拌并在頂部空間中的保持空氣流動(dòng)，G-CSF被氧化并部分重新折疊。添加EDTA至最 終濃度為ImM來結(jié)束氧化。
[0182] 實(shí)施例7 :用AEX批次吸附去除肌氨酰
[0183] 以批次模式將肌氨酰吸附到陰離子交換（AEX)樹脂。每克肌氨酰應(yīng)用20克AG 1-X8樹脂（Bi 〇Rad，USA)，并將其加入溶液。攪拌懸浮液2小時(shí)以結(jié)合大多數(shù)的肌氨酰。然 后通過100 ym孔徑的尼龍袋濾網(wǎng)過濾來去除樹脂。利用隨后的純化步驟，將過濾中剩下的 肌氨酰從產(chǎn)品中去除（實(shí)施例8和9)。
[0184] 實(shí)施例8 :污染物在酸性pH的沉淀
[0185] 通過pH 4. 3-4. 5的酸沉淀，在G-CSF保持可溶的同時(shí)容易地去除一些雜質(zhì)。通過 加入終濃度為IM尿素防止任何潛在的非特異性和不想要的G-CSF的共沉淀。用6M的原液 來提供尿素，并以Idm 3Aiin的速率慢慢加入到實(shí)施例6的濾液中。接下來，加入1/20體積 pH 4. 8的IM乙酸鈉來降低pH。用50%乙酸進(jìn)行滴定進(jìn)一步降低pH至4. 3-4. 5。至少沉 淀1小時(shí)。然后通過深層濾器進(jìn)行過濾（Pall K700/KS50雙層）來去除沉淀的物質(zhì)。
[0186] 實(shí)施例9 :利用串聯(lián)的AEX+CEX色譜去除殘留的肌氨酰和進(jìn)行緩沖液交換
[0187] 使用50mM/pH4. 5的乙酸鈉緩沖液平衡I)4dm3的色譜柱，其填裝DEAE Macro-Prep(Bi〇-Rad，USA)AEX 樹脂，和 2)8dm3的色譜柱，其填裝 Toyopearl SP-650C (Tosoh，Japan) CEX樹脂。兩根柱子以串聯(lián)布置都直接連接在AKTA加工色譜系統(tǒng) 上（GE Healthcare，Sweden)。通過0. 2 μ m的無菌濾器進(jìn)行清除后，將實(shí)施例7的濾液裝載 到第一柱上。殘留的肌氨酰與DEAE樹脂結(jié)合，而G-CSF保持不結(jié)合（非結(jié)合模式）并出現(xiàn) 在第一柱的流過物中。該流過物直接裝載至第二柱（SP樹脂），其結(jié)合G-CSF (結(jié)合模式）。 用20mM Tris-HCl/pH 8洗脫的簡(jiǎn)單步驟使G-CSF從樹脂脫附。除了去除殘留的肌氨酰，通 過該方法還可以實(shí)現(xiàn)從乙酸鈉/pH 4. 5至Tris-HCl/pH 8的緩沖液的交換。
[0188] 實(shí)施例10 :第二重新折疊（完成折疊）
[0189] 在此階段，大約半數(shù)蛋白質(zhì)流分的折疊已完成，而剩余的蛋白質(zhì)不完全折疊或錯(cuò) 誤折疊。用20mM Tris-HCl，pH 8從Toyopearl SP-650C洗脫下G-CSF溶液，然后使其通過 〇.2以111的無菌濾器至不銹鋼容器中。過濾的溶液用水稀釋二倍。在低電導(dǎo)率（<1 1^/(^) 環(huán)境中，pH 8,在2-8°C冷卻下進(jìn)行32-42小時(shí)的用于蛋白質(zhì)折疊的第二溫育（第二折疊）。
[0190] 實(shí)施例11 :使用AEX色譜的純化（精制步驟1)
[0191] 以 DEAE Macro-Pr印(Bio-Rad，USA)填裝色譜柱并用 IOmM Tris-HCl/pH 8 進(jìn)行平 衡。將第二重新折疊得到的溶液（實(shí)施例9)裝載入DEAE柱。用IOmM Tris-HCl/pH 8中 從OmM至200mM的線性遞增的NaCl梯度洗脫液洗脫正確折疊的G-CSF。合并洗脫的G-CSF 并用水2倍稀釋。用50 %乙酸滴定將pH調(diào)整至4. 5。
[0192] 實(shí)施例12 :使用CEX色譜的純化（精制步驟2)
[0193] 對(duì)于最后的精制步驟，從AEX色譜收集的由正確折疊的蛋白質(zhì)組成的G-CSF合并 液（pool)(實(shí)施例10)直接應(yīng)用于填裝有Toyopearl CM-650S樹脂的CEX柱。用20mM pH 5. 3的乙酸鈉平衡柱。用從20mM至400mM乙酸鈉的線性遞增的鹽梯度洗脫結(jié)合的G-CSF， 所述乙酸鈉的體積在24倍柱體積以內(nèi)，pH5. 3。收集具有純G-CSF的流分并將其合并用于 配制（formulation) 〇
[0194] 實(shí)施例12b :運(yùn)用凝膠色譜的純化G-CSF的配制
[0195] 從CEX柱洗脫的純化的G-CSF(實(shí)施例11)通過0. 2 ym的無菌濾器進(jìn)行過濾，然 后通過填裝有S印hadex G-25細(xì)粒樹脂的Hdm3柱，該柱用配制緩沖液（IOmM乙酸鈉，pH 4， 5%山梨醇，和0.006%聚山梨醇酯80)平衡。洗脫（running)緩沖液使用相同的緩沖液。 用配制緩沖液洗脫空隙中的G-CSF。對(duì)于整個(gè)批次（35-48g G-CSF)，在S印hadex G-25上 進(jìn)行隨后的三批配制，其中每一批用濾過的CEX洗脫液的1/3。用配制緩沖液稀釋將配制的 G-CSF的濃度調(diào)整到0. 9-1. 0mg/ml，最后通過0. 2 μ m的無菌囊式過濾器進(jìn)行過濾。配制好 的G-CSF是無菌溶液，非常穩(wěn)定，并且可以在2-8°C下儲(chǔ)存即使沒有幾年也有很多個(gè)月。
[0196] 實(shí)施例13 :分析方法
[0197] 按照歐洲藥典（Ph. Eur.)實(shí)施已知的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，歐洲藥典含有非格司亭的專 題，描述特定的分析方法（歐洲藥品與衛(wèi)生保健質(zhì)量管理局（European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care，EDQM) (2010):非格司亭濃縮溶液，歐洲藥典 7.0,2015-2018)。該專題作為基本技術(shù)在歐洲藥典的其他章節(jié)中交叉引用。這些特別提到 的章節(jié)在以下實(shí)施例中在方括號(hào)中引用，其提供了此技術(shù)的更詳細(xì)的描述。所利用的參照 標(biāo)準(zhǔn)可以是歐盟批準(zhǔn)用于醫(yī)療用途的官方認(rèn)證的商業(yè)上可購買的授權(quán)藥品（非格司亭）， 或使用這些商業(yè)參照校正的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。為了根據(jù)國(guó)際單位（IU)分析相對(duì)效能，另外使用了 世界衛(wèi)生組織（WHO)的國(guó)際G-CSF標(biāo)準(zhǔn)。用于對(duì)純度、特定的雜質(zhì)、G-CSF相關(guān)的蛋白質(zhì)和 生物學(xué)活性（效能）進(jìn)行分析的測(cè)試方法根據(jù)歐洲藥典專題進(jìn)行應(yīng)用，僅經(jīng)過很少的修改。 因此，這些本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分析方法僅簡(jiǎn)述如下。
[0198] 實(shí)施例 13. 1-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE) : [Ph. Eur. 7, 2. 2. 31] JDS-PAGE 用 于確定分子大小，G-CSF的同一性和純度。凝膠有12% PA，且包括十二烷基硫酸鈉（SDS)。 在還原和非還原條件下使用該方法。凝膠用Sypro ruby染色。使用一組具有明確質(zhì)量的 標(biāo)記蛋白質(zhì)計(jì)算相對(duì)分子量（Mr)。
[0199] 實(shí)施例13. 2-高效體積排阻色譜（SEC-HPLC) : [Ph. Eur. 7, 2. 2. 30]。SEC用于檢測(cè) 雜質(zhì)或分子量高于非格司亭的G-CSF相關(guān)物質(zhì)（二聚體、聚集物）。蛋白質(zhì)的檢測(cè)基于紫 外吸收。純度（主峰）和雜質(zhì)（二聚體、聚集物）用每種成分的活性物質(zhì)的面積％來表示。 用重復(fù)測(cè)量的平均值計(jì)算測(cè)試結(jié)果。圖2顯示純化的G-CSF批次（3B)與參照標(biāo)準(zhǔn)（3A)比 較的SEC色譜圖的例子。主峰左邊可見痕量的聚集物。主峰右邊的峰是溶劑造成的并不是 雜質(zhì)。
[0200] 實(shí)施例 13. 3-反相高壓液相色譜（RP-HPLC) : [Ph. Eur. 7, 2. 2. 29]。RP-HPLC 用于 確定G-CSF的同一性，計(jì)算G-CSF含量和純度。該方法同樣用于定性和定量產(chǎn)物相關(guān)的物 質(zhì)。蛋白的檢測(cè)基于紫外吸收。相關(guān)的蛋白雜質(zhì)用活性物質(zhì)的百分比面積）表示。用 重復(fù)測(cè)量的平均值計(jì)算測(cè)試結(jié)果。
[0201] 實(shí)施例13. 4-等電聚焦凝膠電泳（IEF) : [Ph. Eur. 7, 2. 2. 54]。該方法用于檢測(cè)雜 質(zhì)或電荷不同于G-CSF的產(chǎn)物相關(guān)物質(zhì)（例如去酰胺化的G-CSF)。用含有基于兩性電解質(zhì) 的固定PH梯度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離。另外，使用具有明確等電點(diǎn)（pi)的一組標(biāo)記 蛋白質(zhì)計(jì)算各蛋白質(zhì)條帶的pi。
[0202] 實(shí)施例13. 5-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA):該方法用于定量測(cè)定大腸桿菌宿主細(xì) 胞蛋白（HCP)水平。該測(cè)試使用商業(yè)上可購買的（通用的）酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒（Cygnus Technologies，no. F410)進(jìn)行。微量滴定板的固相使用親和純化的多克隆抗大腸桿菌抗體 覆蓋，所述抗體從實(shí)驗(yàn)樣品中捕捉HCP。標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP)的抗大腸桿菌抗體示蹤 物自發(fā)結(jié)合HCP并且得到的結(jié)合物抗洗滌程序。結(jié)合的HCP，以及HRP分別在過氧化氫的存 在下通過底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)的氧化進(jìn)行檢測(cè)。光密度用ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)量。用 通過測(cè)量不同濃度的HCP校正物（calibrator)(試劑盒提供）得到的校準(zhǔn)圖來進(jìn)行定量。 按照提供商的說明準(zhǔn)確進(jìn)行該方法。HCP濃度以ng/ml或ng/mg (ppm)表達(dá)。
[0203] 實(shí)施例13. 6-定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR):該試驗(yàn)用來測(cè)定大腸桿菌宿主細(xì)胞 DNA。應(yīng)用商業(yè)可得的試劑盒，特指"resDNASEQ?大腸桿菌殘留DNA定量系統(tǒng)"，其基于實(shí)時(shí) TaqMan? qPCR技術(shù)（Applied Biosystems)。該方法在檢測(cè)DNA污染時(shí)是非常敏感和特異 的。該試驗(yàn)基于序列特異性擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)明確定義的DNA片段，所述擴(kuò)增和檢測(cè)通 過使用特定序列的引物（SSP)和熒光標(biāo)記的雜交探針(TaqMan?)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 進(jìn)行。根據(jù)提供商的說明書進(jìn)行包括儀器、試劑、取樣和基于軟件的計(jì)算的整個(gè)方法。
[0204] 實(shí)施例13. 7-細(xì)菌內(nèi)毒素：[Ph. Eur. 7, 2. 6. 14,方法C]。革蘭陰性菌內(nèi)毒素的檢 測(cè)基于來自馬蹄蟹（鱟（Limulus polyphemus))的變形細(xì)胞溶解物，已經(jīng)是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方 法。根據(jù)歐洲藥典，使用濁度動(dòng)態(tài)技術(shù)（方法C)進(jìn)行鱟試驗(yàn)（"LAL試驗(yàn)"）。結(jié)果用與國(guó) 際內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)BRP相關(guān)的國(guó)際單位（IU)表示。
[0205] 實(shí)施例13. 8-生物學(xué)活性的測(cè)定（相對(duì)效能）：G-CSF樣品的生物學(xué)活性用基于 細(xì)胞的體外增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試，該實(shí)驗(yàn)描述在非格司亭專題中，并帶有下列改變。生物測(cè)定 方法基于比較NFS-60細(xì)胞增殖的改變，該細(xì)胞源自鼠成髓細(xì)胞系。用測(cè)試樣品的系列稀釋 溶液和空白對(duì)照溶液平行地處理NFS-60細(xì)胞。G-CSF可以顯著并特異地刺激NFS-60細(xì)胞 的增殖。細(xì)胞增殖在微量培養(yǎng)板上進(jìn)行72小時(shí)。使用底物刃天青（ alamar?: Blue)檢測(cè) 增殖效果，該底物能被有活力的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成熒光染料試鹵靈。熒光信號(hào)具有高敏的檢測(cè)性。 劑量響應(yīng)曲線用平行線測(cè)定法計(jì)算，在該曲線的直線部分具有至少三個(gè)點(diǎn)，該計(jì)算被用作 統(tǒng)計(jì)評(píng)估?？山邮艿姆秶啾容^對(duì)照溶液在80%和125%之間。相對(duì)活力用國(guó)際單位（IU) 表達(dá)，其通過內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正至非格司亭的WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行定義。具有完全活性的純?nèi)?類G-CSF具有I. 0 X IO8IUAig的特定生物學(xué)活力。
[0206] 實(shí)施例13. 9-肽作圖：[Ph. Eur. 7, 2. 2. 55]。質(zhì)譜（MS)分析之前的肽作圖用于分 析二硫鍵?；跉W洲藥典的非格司亭專題開發(fā)了肽鍵的酶切程序。用于剪切的蛋白酶是谷 氨?；逆渻?nèi)切酶（EndoGlu-C)。37°C溫育24小時(shí)，停止溫育，加入8M GuHCl并煮沸。在 還原條件和非還原條件下進(jìn)行肽作圖程序。還原和非還原條件下的肽譜在質(zhì)譜中的差異證 明二硫鍵的位置。完全折疊的完整G-CSF(非格司亭）在Cys37-Cys43和Cys65-Cys75位 置具有兩個(gè)二硫鍵，而在位點(diǎn)18, 一個(gè)半胱氨酸殘基是游離的。
[0207] 或者，蛋白水解消化之后從G-CSF樣品得到的肽可以用RP-HPLC分離并用UV檢 測(cè)。用測(cè)試溶液得到的指紋樣色譜圖與用對(duì)照材料得到的色譜圖進(jìn)行比較，該方法提供了 比較數(shù)據(jù)。
[0208] 參考文獻(xiàn)列表
[0209]