為約20-28°C進(jìn)行，和/或進(jìn)行約15-25小 時(shí)。
[0119] 上述步驟（c)中增溶劑的去除可以包括：AEX(陰離子交換）和CEX(陽(yáng)離子交換）， 任選地，以此順序排列。上述步驟（c)中增溶劑的去除可以包括：
[0120] a)通過(guò)將懸浮的樹(shù)脂材料與重組蛋白溶液混合以結(jié)合陰離子交換樹(shù)脂材料并通 過(guò)過(guò)濾去除樹(shù)脂材料，和/或
[0121] b)進(jìn)行離子交換色譜，在增溶劑與樹(shù)脂結(jié)合并且所述重組蛋白保留在流過(guò)物 (flow through)中的條件下進(jìn)行，和/或，
[0122] c)進(jìn)行離子交換色譜，在重組蛋白與樹(shù)脂結(jié)合并且所述增溶劑保留在流過(guò)物中的 條件下進(jìn)行。
[0123] 所述增溶劑和其他雜質(zhì)可以通過(guò)順序應(yīng)用以下步驟去除：AEX、酸沉淀、AEX和 CEX。所述增溶劑和其他雜質(zhì)可以通過(guò)順序應(yīng)用以下步驟去除：
[0124] a)通過(guò)將懸浮的樹(shù)脂材料與重組蛋白溶液混合使所述增溶劑與陰離子交換樹(shù)脂 材料結(jié)合并通過(guò)過(guò)濾去除樹(shù)脂材料；
[0125] b)降低pH低于5以沉淀雜質(zhì)并通過(guò)過(guò)濾去除沉淀物；
[0126] c)進(jìn)行陰離子交換色譜，在殘留的增溶劑與樹(shù)脂結(jié)合并且重組蛋白保持在流過(guò)物 中的條件下進(jìn)行；
[0127] d)進(jìn)行陽(yáng)離子交換色譜，在重組蛋白與樹(shù)脂結(jié)合并且殘留的增溶劑保持在流過(guò)物 中的條件下進(jìn)行；和
[0128] e)通過(guò)使用具有升高的pH或鹽濃度的洗脫緩沖液的分步或梯度洗脫，從陽(yáng)離子 交換樹(shù)脂洗脫結(jié)合的重組蛋白。
[0129] 第二重新折疊步驟可以在低電導(dǎo)率緩沖液中和/或在冷卻的條件下進(jìn)行，和/或 進(jìn)行大于12小時(shí)。第二重新折疊步驟可以在電導(dǎo)率低于2. OmS/cm，和/或溫度為約2-8°C 進(jìn)行，和/或進(jìn)行至少24小時(shí)。第二重新折疊步驟可以在高于pH7的pH進(jìn)行。
[0130] 以上描述的重新折疊來(lái)自包涵體重組蛋白的方法可以進(jìn)一步包括精制的步驟，其 可以包括一次或多次離子交換色譜。精制步驟中的一次或多次離子交換色譜可以包括陰離 子交換色譜以及隨后的陽(yáng)離子交換色譜。
[0131] 各種步驟現(xiàn)如下描述：
[0132] 溶解：在增溶劑的存在下溶解IB流分的重組物。可以使用任何合適的增溶劑。這 樣的增溶劑可以選自，例如（但不限于）變性劑或促溶劑，例如（但不限于）GuHCl或尿素， 或選自洗絳劑、表面活性劑（tenside)或表面活性劑（surfactant)，例如（但不限于）月 桂酰肌氨酸（肌氨酰）、月桂酸、十二烷基硫酸鈉（SDS)或十六烷基三甲基氯化銨。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，用肌氨酰在堿性pH進(jìn)行溶解，優(yōu)選pH 8,優(yōu)選肌氨酰濃度為0.2-2. 0% (w/ v)，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中約〇. 5-1% (w/v)以及最優(yōu)選地約1% (w/v)或1% (w/v)。用 于溶解的優(yōu)選緩沖液是Tris-HCl/pH 8,優(yōu)選40mM Tris-HCl/pH 8。溶解后，可以用水或低 電導(dǎo)率（即電導(dǎo)率至少低于2mS/cm，更優(yōu)選低于lmS/cm)緩沖液進(jìn)行稀釋步驟。
[0133] 第一重新折疊步驟（氧化性折疊）：在有效量的增溶劑例如肌氨酰和氧化劑例如 CuS04(或其他例如氧氣或空氣流（氣泡）、GSSG (氧化型谷胱甘肽）、金屬離子（Cu2+，F(xiàn)e2+， Zn2+，...）、過(guò)氧化氫（H 2O2))的存在下進(jìn)行第一次氧化性重新折疊的步驟。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在 增溶劑例如肌氨酰的存在下，不能完全完成重組蛋白的折疊。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在不存在增溶劑 的情況下，即完全去除增溶劑然后進(jìn)行第二次折疊步驟，導(dǎo)致重組蛋白的產(chǎn)量改善。
[0134] 去除增溶劑和氧化劑以及其他污染物：可以使用任何合適的去除方法。例如，可通 過(guò)離子交換樹(shù)脂吸附，和/或酸沉淀，和/或離子交換色譜完成充分去除。應(yīng)用任何這些技 術(shù)的一種或其組合可以導(dǎo)致增溶劑，例如肌氨酰，的濃度不干擾第二重新折疊步驟中的重 新折疊所述濃度優(yōu)選低于〇. 〇lmg/ml，優(yōu)選低于檢測(cè)限。（可以使用以紫外檢測(cè)的HPLC測(cè) 量殘留增溶劑的濃度。該方法更詳細(xì)地描述于Burgess，R.R.1996，Purification of over produced E.coli RNA polymerase 〇 factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from sarkosyl.Methods Enzymol. 273 :145-149 中。）只要能夠完全去除增溶 劑，這些純化步驟可以以任何順序和/或任意組合施用。也可以使用其他合適的純化方法。 可以通過(guò)順序應(yīng)用以下步驟去除增溶劑和其他雜質(zhì)：AEX、酸沉淀、AEX和CEX。進(jìn)行離子交 換樹(shù)脂吸附酸沉淀和離子交換色譜，例如AEX或CEX的合適材料和條件是本領(lǐng)域已知的并 且商業(yè)上可獲得的。
[0135] 第二重新折疊（折疊的完成）：第二重新折疊步驟包括稀釋?zhuān)缬盟虻碗妼?dǎo)率 緩沖液稀釋兩倍，然后溫育部分重新折疊的G-CSF，優(yōu)選在溫和堿性pH，例如pH 8。用于第 二重新折疊步驟的優(yōu)選緩沖液是Tris-HCl/pH 8,優(yōu)選IOmM Tris-HCl/pH 8。
[0136] 最后的純化（精制步驟）：任選地，可以進(jìn)行進(jìn)一步的精制步驟，任選地包括AEX 和/或CEX，直到達(dá)到需要的重組蛋白純度。 實(shí)施例
[0137] 實(shí)施例1 :
[0138] G-CSF 的生產(chǎn)
[0139] 材料和方法
[0140] 1.宿主細(xì)胞系的生成
[0141] T7 RNA聚合酶盒的制備
[0142] 為了分離含有功能性T7 RNA聚合酶（登錄號(hào)AY264774,蛋白AAP33914.1)的 4. 44kb基因盒，其與Iac操縱子的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可操作地連接，使用來(lái)自大腸桿菌BL21 (DE3) 菌株（Novagene)的基因組 DNA。用 Quiagen Genomic tip-20 試劑盒（Quiagen，Hilden， Germany)使用標(biāo)準(zhǔn)程序制備所述DNA。然后通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增T7盒。使用含有KOD HiFi DNA聚合酶（Merck，Darmstadt，Germany)在100 μ 1反應(yīng)體積中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)混合物含 有 DNA 聚合酶緩沖液、5U KOD HiFi DNA 聚合酶、2mM MgCl2、250 yM dNTPUOOng DNA 模板、 10 μ M正向引物（IntLambd 1)、10 μ M反向引物（IntLambd 2)。以下列設(shè)定使用PCR儀[MJ Research PTC-200]進(jìn)行反應(yīng)：98°C下變性30秒，接著進(jìn)行98°C 30秒，65°C 30秒（退火）， 72°C2分鐘（合成）的周期，35個(gè)循環(huán)（變性）。最后的合成在72°C進(jìn)行10分鐘。
[0143] 使用來(lái)自λ噬菌體Int基因的下列引物進(jìn)行PCR反應(yīng)：
[0144] IntLambd 1 ：
[0145] GTCCGACTTATGCCCGAGAAGATGTTGAGCAAACTTATCGCTTATC
[0146] IntLambd 2 :
[0147] TGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCG
[0148] 用Millipore Montage PCR Cleanup試劑盒從PCR溶液純化DNA。將來(lái)自 Qiaquick 凝膠提取試劑盒的三體積凝膠溶解溶液添加到反應(yīng)溶液中，然后將樣品離心。然后加入 400 μ 1的水和凝膠溶解溶液混合物（以1 : 3的比例混合）。離心后，用3 X 400 μ I TE緩沖 液洗滌留在濾器上的DNA，然后用45 μ 1無(wú)菌水收集所述DNA。向分離的PCR產(chǎn)物添加5 μ 1 BamHI緩沖液，在37。。用10單位的BamHI限制性酶消化混合物4小時(shí)，然后根據(jù)上述的程 序進(jìn)行純化。使用HiSpeed Plasmid Midi試劑盒純化從XLl-Blue MRF細(xì)胞純化pBR322 質(zhì)粒。在37°C，在用BamHI緩沖液制備的20 μ 1反應(yīng)混合物中，用5單位的BamHI限制酶消 化1 μ g純化的質(zhì)粒4小時(shí)。為了避免載體的自我閉合，用0. 5單元的ΒΑΡ(細(xì)菌堿性磷酸 酶）酶（60°C下溫育30分鐘）剪切連接在末端的磷酸基團(tuán)。用1% TAE瓊脂糖凝膠分離所 述載體并使用Qiaquick凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化。根據(jù)試劑盒的操作程序進(jìn)行純化，結(jié)束 時(shí)載體稀釋為50 μ 1體積?；旌霞兓妮d體和插入物，并在200 μ 1反應(yīng)混合物中用T4 DNA 連接酶16°C處理過(guò)夜。處理后，用3體積的乙醇沉淀DNA，蒸發(fā)后用50 μ 1無(wú)菌水溶解。
[0149] 整合型構(gòu)建體的產(chǎn)生
[0150] 為了將上述的分離的Τ7 RNA聚合酶盒導(dǎo)入到修飾的BL21大腸桿菌菌株 C2523H(New England Biolabs)的染色體的DNA中，將上述的分離的Τ7 RNA聚合酶盒克隆 入705-pmi質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)。
[0151] 為了制備整合型構(gòu)建體，在50μ1 Sail緩沖液中用Clal/Sall酶剪切來(lái)自 4 μ gpBR322/T7質(zhì)粒的插入物，該質(zhì)粒使用HiSpeed Plasmid Midi試劑盒從XLl-Blue MRF 細(xì)胞[Stratagene]獲得。所述消化在37°C持續(xù)4小時(shí)。消化得到2個(gè)片段，pBR322的 Clal/Sall片段和含有T7聚合酶的片段。
[0152] 使用 HiSpeed Plasmid Midi 試劑盒從 XLl-Blue MRF 細(xì)胞獲得 pLacZ 載體。在 37°C應(yīng)用EcoRI/Clal酶處理4小時(shí)，從pLacZ載體去除LacZ基因末端。用0. 01單位EcoRI 酶將 2yg 轉(zhuǎn)化 DH5a[Invitrogen]的 705-pMJ 質(zhì)粒[Gene Bridges GmbH]在 EcoRI 緩沖液 中部分消化30分鐘，該質(zhì)粒是使用HiSpeed Plasmid Midi試劑盒純化的。部分消化的質(zhì) 粒DNA用Qiaquick凝膠提取試劑盒純化，然后在37°C用Sail酶在Sail緩沖液中消化4小 時(shí)，然后在60°C用0. 5單位的BAP酶（細(xì)菌堿性磷酸酶）對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行30分鐘的去磷酸化。
[0153] 用1% TAE瓊脂糖凝膠電泳分離插入物和載體，并使用Qiaquick凝膠提取試劑盒 分別純化，然后以200ml體積混合并連接16小時(shí)。
[0154] 然后用乙醇沉淀DNA，蒸發(fā)后將其電穿孔轉(zhuǎn)入含有插入到pET3d.載體的RFP蛋白 基因的DH5a細(xì)胞（進(jìn)行為增殖705-pMJ質(zhì)粒，且使用衍生的DH5a細(xì)胞，從而以合適的 量獲得所述質(zhì)粒）。增殖紅色細(xì)胞中的4個(gè)，并分析所述質(zhì)粒是否含有整個(gè)插入物。得到 的構(gòu)建體命名為 pMJ-LacI-LacUV-T7Pol-LacZ。接下來(lái)，用 HiSpeed Plasmid Midi 試劑盒 (Quiagen)純化 pMJ-LacI-LacUV-T7Pol-LacZ 質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化入 C2523 修飾的 BL21 細(xì)胞。
[0155] 2. G-CSF表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的生成
[0156] G-CSF表達(dá)載體：
[0157] 構(gòu)建用于G-CSF的特定表達(dá)載體。例如EP 0 401 384作為示例公開(kāi)了 N-(L-蛋 氨酸基）粒細(xì)胞集落刺激因子（metHuG-CSF)的525bp長(zhǎng)的全長(zhǎng)人類(lèi)cDNA序列，其編碼具 有額外N末端蛋氨酸殘基的、與人類(lèi)G-CSF同種型具有相同的174個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
[0158] 如下創(chuàng)建表達(dá)構(gòu)建體：將r-metHuG-CSF DNA (登錄號(hào)AR049895)插入修飾的 pET39b載體（New England Biolabs)的NdeI-XhoI 位置，創(chuàng)建pRG/GCSFa質(zhì)粒，如 Sambrook J.，F(xiàn)ritsch E. F.，和 Maniatis T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,Vol. 1,2, 3(1989)和 Glover D.M.，IRL Press，Oxford，1985 描述的。
[0159] 5234bp長(zhǎng)的pRG/GCSFa載體含有：抗生素（卡那霉素）抗性基因（Kan)(位置： 822-7, T7啟動(dòng)子）、合成的r-metHuG-CSF基因（G-CSF)、T7終止子、IacI阻遏物（LacI)和 復(fù)制起始點(diǎn)（〇ri)。圖1描繪了載體的概述圖。
[0160] 使用電穿孔法將載體轉(zhuǎn)化入在第1點(diǎn)得到的宿主細(xì)胞。
[0161] 3.細(xì)胞培養(yǎng)
[0162] 無(wú)菌條件下，將WCB (工作細(xì)胞庫(kù)）細(xì)菌細(xì)胞懸浮液接種到IOOrnl無(wú)菌種子培養(yǎng)基 (RBY)。37°C，185rpm持續(xù)攪拌，溫育接種的種子培養(yǎng)物24小時(shí)。當(dāng)種子培養(yǎng)物的600nm光 密度達(dá)到1. 0,將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到20L的生物反應(yīng)器中（工作體積為15L)。37°C，400rpm 持續(xù)攪拌，并以15L/min的速率通氣，溫育接種的種子培養(yǎng)物18小時(shí)。當(dāng)種子培養(yǎng)物的 600nm光密度達(dá)到約0. 9,將收集的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到有GBA培養(yǎng)基的1000L的生物反應(yīng)器 中（工作體積為500L)，所述GBA培養(yǎng)基含有合成的成分和甘油作為碳源。在37°C，嚴(yán)格的 有氧條件（DO多30% )下以浸沒(méi)培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。整個(gè)培養(yǎng)時(shí)期pH值保持在6. 8-7. 2的范 圍。
[0163] 當(dāng)溶解氧（DO)水平開(kāi)始從起始點(diǎn)（DO = 40% )迅速增加時(shí)，開(kāi)始線性補(bǔ)料添加。 當(dāng)培養(yǎng)物的光密度達(dá)到600nm光密度30,把發(fā)酵溫度降低到32°C。降低溫度后，將IPTG添 加到培養(yǎng)物中以誘導(dǎo)高水平的目標(biāo)蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)5個(gè)小時(shí)后，通過(guò)關(guān)掉碳源補(bǔ)料和降 低攪拌和通氣停止發(fā)酵，冷卻細(xì)胞培養(yǎng)物至低于15°C然后收獲細(xì)胞。主要的發(fā)酵一共進(jìn)行 21小時(shí)。
[0164] 在培養(yǎng)基中使用甘油作為碳源。作為碳源，甘油導(dǎo)致高的生長(zhǎng)速率和高的生物量。 補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分包括氨基酸（L-蛋氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸）和礦物質(zhì)（例如鹽、磷 酸鹽、硫酸鹽）。所有使用的材料都來(lái)自無(wú)動(dòng)物的來(lái)源。使用SB2020作為消沫劑。發(fā)酵培 養(yǎng)基進(jìn)一步包含硫酸卡那霉素（一種氨基糖苷類(lèi)抗生素）作為選擇劑。
[0165] 4.中游處理
[0166] 1.包涵體（IB)的制備
[0167] 發(fā)酵后，進(jìn)行包涵體的制備。停止攪拌、通氣和碳源補(bǔ)料，冷卻培養(yǎng)物至低于15°C 然后通過(guò)在11 〇〇〇g分離收集細(xì)菌。細(xì)胞在轉(zhuǎn)子中沉淀下來(lái)然后用水洗出（排出）。收集 細(xì)菌細(xì)胞濃縮液，用水稀釋至一半的體積，加入0.5M NaH2PO4，最終濃度為10mM。三次通過(guò) 勻漿器以在壓力（IOOMPa)下破碎細(xì)胞。通過(guò)在分離器中11 OOOg沉淀，將包涵體從細(xì)胞碎 片分離。用洗滌緩沖液將沉淀的包涵體排出，所述緩沖液含有5mM DTT，IOmM NaH2PO4, 5mM EDTA，和2%吐溫20, pH 7. 2。用相同的緩沖液將濃縮的IB懸浮液稀釋2倍并再次沉淀。 使用IOmM NaH2PO4緩沖液重復(fù)該洗滌程序兩次，第二次洗滌結(jié)束時(shí)不稀釋。最后的IB沉淀 物在-80 °C冷凍儲(chǔ)存并能穩(wěn)定8個(gè)月。
[0168] 解凍包涵體后，可以用本領(lǐng)