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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生產(chǎn)包涵體中的重組多肽的方法，所述方法包括 (a) 在第一溫度培養(yǎng)一種微生物宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含編碼所述重組多肽的核酸， (b) 將培養(yǎng)溫度從所述第一溫度降低到第二溫度，和 (c) 在所述第二溫度培養(yǎng)所述微生物宿主細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物宿主細(xì)胞是大腸桿菌（E.coli)。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一溫度在36°C和38°C之間。
4. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述第一溫度是37°C。
5. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述第二溫度在25°C和36°C之間。
6. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述第二溫度在30°C和36°C之間，更優(yōu)選在 30 °C和35 °C之間，更優(yōu)選在31 °C和33 °C之間。
7. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在所述第一溫度和/或第二溫度培養(yǎng)期間的pH 在6和8之間。
8. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述第一溫度和/或第二溫度下培養(yǎng)的pH在 6. 8和7. 2之間。
9. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物的600nm光密度達(dá)到10和50之 間時(shí)降低溫度。
10. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物的600nm光密度達(dá)到27和33之 間時(shí)降低溫度。
11. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述重組多肽是四螺旋束多肽。
12. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述重組多肽是G-CSF。
13. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述重組多肽是G-CSF，并且其中該G-CSF是 人類或牛G-CSF，任選地，在-1位置分別具有起始蛋氨酸殘基。
14. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述核酸與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作連接。
15. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，在步驟（a)至（c)之前是將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 的步驟，所述表達(dá)載體包含編碼所述重組多肽的核酸，其中該核酸與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作 連接。
16. 權(quán)利要求14或15的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是17啟動(dòng)子。
17. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述微生物宿主細(xì)胞的染色體包含編碼噬菌 體RNA聚合酶的核酸序列，并且不含溶源性噬菌體核酸序列，任選地，所述核酸序列與lac 啟動(dòng)子可操作連接。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述噬菌體RNA聚合酶是17聚合酶。
19. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述多肽的表達(dá)是通過加入誘導(dǎo)物進(jìn)行的。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中在降低溫度的同時(shí)或之后加入所述誘導(dǎo)物。
21. 權(quán)利要求19或20的方法，其中所述誘導(dǎo)物是IPTG。
22. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述載體包含SEQIDNO:4的序列。
23. 前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述編碼所述重組多肽的核酸選自： ⑴編碼SEQIDNO:3或SEQIDNO:1的多肽的核酸序列；和 (ii)編碼與SEQIDNO:3所示的序列具有至少90%序列相同性的多肽的核酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了從包涵體生產(chǎn)重組多肽的新方法。細(xì)胞培養(yǎng)條件的調(diào)整對(duì)活性形式的重組多肽的產(chǎn)率有積極影響。一方面，該方法包括(a)在第一溫度培養(yǎng)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含編碼重組多肽的核酸，(b)將培養(yǎng)溫度從第一溫度降低到第二溫度，和(c)在所述第二溫度培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
【IPC分類】C07K14-535, C12P21-02
【公開號(hào)】CN104603280
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380015530
【發(fā)明人】F·費(fèi)爾弗爾迪, K·歐洛斯, J·科茲馬
【申請(qǐng)人】吉瑞工廠
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2013年3月18日
【公告號(hào)】CA2867794A1, EP2828396A2, US20150044721, WO2013068602A2, WO2013068602A3