如人類G-CSF序列）的蛋白質(zhì)。二 者選一或額外地，"變體"可以具有其他修飾，例如甲基化、聚乙二醇化、琥珀?；⑻砑悠渌?標(biāo)簽或標(biāo)記等。所述變體可以是酶促或化學(xué)修飾的G-CSF。它可以是融合其他肽或多肽的 融合蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，所述G-CSF是聚乙二醇化的。
[0053] 變體可以是天然變體（參見例如Zsebo 1986)，包括等位基因變體，或合成產(chǎn)生的 變體。現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)顯示G-CSF的修飾形式以包涵體表達(dá)。因此可以使用本文描述的改進(jìn) 的方法獲得變體。例如，EP0719860在實施例2和3中描述了修飾的牛G-CSF的構(gòu)建和生 產(chǎn)。
[0054] 在一些實施方案中，所述G-CSF變體是與SEQ ID NO :3 (r-met-hu-G-CSF =非格 司亭）具有至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99. 5%序列相同性的蛋白質(zhì)。 序列相同性可以使用標(biāo)準(zhǔn)序列分析工具進(jìn)行確定，例如Clustal，BLAST等或比對算法例如 Needleman-Wunsch算法，Smith-Waterman算法等。所述變體可以具有一個或多個保守氨基 酸取代。如果一個氨基酸被具有相似性質(zhì)的氨基酸取代，例如極性氨基酸被另一個極性氨 基酸替代，酸性氨基酸被另一個酸性氨基酸替代等，那么氨基酸取代是保守的。保守取代不 大可能影響蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)從而影響其功能。因此與SEQ ID NO :3相比，G-CSF的"變 體"包括在一個或多個氨基酸進(jìn)行一個或多個突變、刪除、取代、插入和/或修飾的蛋白，只 要G-CSF的變體仍然表現(xiàn)出與G-CSF相同的生物學(xué)功能（功能型等價物）。變體是否具有 相同的生物學(xué)功能可以通過確定G-CSF的生物學(xué)活性的試驗進(jìn)行測試（參見例如實施例13 列出的方法）。商業(yè)上可獲得的G-CSF可以用作參考對照。如果變體具有作為對照的商業(yè) 上可得的G-CSF，例如非格司亭的至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至 少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或至少99. 5 %的 活性，可以認(rèn)為該變體具有"相同生物學(xué)活性"，即"生物學(xué)上具有活性"或"有活性的"。
[0055] 因此本文的"G-CSF"包括人類G-CSF的物種直系同源物和變體，即功能性變體。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可以調(diào)整的參數(shù)包括溫度、pH、光密度、溶解氧水平 (DO)、加料速率、碳源和其他對活性重組蛋白產(chǎn)量有積極影響的其他參數(shù)。
[0057] 溫度
[0058] 在本發(fā)明的一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)的溫育溫度從較高的第一溫度降低到較低 的第二溫度。在宿主細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)期間降低溫度。在較低溫度，細(xì)胞從生長階段改變至生 產(chǎn)階段。在一些實施方案中，所述第一溫度在36°C至38°C之間。在優(yōu)選的實施方案中，所 述第一溫度在36. 5°C至37. 5°C之間，或者36. 7°C至37. 2°C之間，在更優(yōu)選的實施方案中， 所述第一溫度是約37°C，在更優(yōu)選的實施方案中，所述第一溫度是37°C。
[0059] 按照本文使用的，如果值的范圍為例如"在X和y之間"，那么X和y的特定值包括 在該范圍內(nèi)，除非另有明確說明。
[0060] 宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)在第一溫度進(jìn)行第一培養(yǎng)時期的溫育。所述第一培養(yǎng)時期可 以在6至48小時之間，但依據(jù)實際細(xì)胞培養(yǎng)可以變短或延長。在優(yōu)選的實施方案中，所述 第一培養(yǎng)時期可以在5至40小時，或10至36小時，或10至32小時，或14至28小時，或 18至24小時之間。特別地，所述第一培養(yǎng)時期可以是10、12、12. 5、14、17、18、19、20、21、 22、23、24小時，或這些值中的兩個的任何組合所定義的一段時間。還可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物 的光密度來確定第一培養(yǎng)時期的時間（如下）。
[0061] 第一培養(yǎng)時期之后，將溫度降低到較低的第二溫度，如僅通過重設(shè)發(fā)酵罐的溫度 來進(jìn)行。在一些實施方案中，所述第二溫度可以在25°C至36°C之間，或26°C至36°C之間， 或27 °C至36 °C之間，或28 °C至36 °C之間，或29 °C至36 °C之間。在優(yōu)選的實施方案中，所述 第二溫度可以在30°C至36°C之間，或30. 5°C至36°C之間，或31°C至36°C之間，或32°C至 36 °C之間，或33 °C至36 °C之間，或34°C至36 °C之間，或35 °C至36 °C之間，或30 °C至35 °C之 間，或30. 5°C至35°C之間，或31°C至35°C之間，或32°C至35°C之間，或33°C至35°C之間，或 34°C至35 °C之間，或30 °C至34°C之間，或30. 5 °C至34°C之間，或31 °C至34°C之間，或32 °C 至34°C之間，或33°C至34°C之間。在優(yōu)選的實施方案中，第二溫度可以是30°C、30. 5°C、 31 °C、32 °C、33 °C、34°C、35 °C或36 °C，或這些值中的兩個的任何組合所定義的范圍內(nèi)。優(yōu)選 的，第二溫育溫度在30°C至35°C之間或在30°C至34°C之間。更優(yōu)選地，第二溫育溫度在約 31°C至約34°C之間，或31°C至34°C之間，更優(yōu)選31°C至33°C之間。最優(yōu)選地，第二溫育溫 度是約32°C或32°C。
[0062] 宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)在第二溫度下進(jìn)行第二培養(yǎng)時期的溫育。所述第二培養(yǎng)階段 可以在1至20小時之間，但依據(jù)實際細(xì)胞培養(yǎng)可以變短或延長。在優(yōu)選的實施方案中，所 述第二培養(yǎng)階段可以在1至20小時，或2至16小時，或3至14小時，或3至10小時，或3 至8小時，或3至6小時，或4至14小時，或4至10小時，或4至8小時，或4至6小時，優(yōu) 選 5 小時。特別地，第二培養(yǎng)階段可以是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20小時，或這些值中的兩個的任何組合所定義的一段時間。
[0063] pH
[0064] pH在第一和/或第二培養(yǎng)溫度/時期可以保持在特定值以內(nèi)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)pH在 6至8之間是特別有益的并且進(jìn)一步促進(jìn)了所表達(dá)的蛋白質(zhì)的高產(chǎn)量，6. 8至7. 2之間的pH 是特別優(yōu)選的。本文描述的方法因此可以包含一或多個測量pH的步驟。pH在第一和/或 第二培養(yǎng)溫度/時期可以保持在6至8,或6. 5至7. 8,或6. 6至7. 4,或6. 7至7. 3,或6. 8 至 7. 2,或 6. 9 至 7. 1，6. 9 至 7. 0,或 6. 6 至 7. 2,或 6. 7 至 7. 2,或 6. 8 至 7. 2,或 6. 9 至 7. 2， 或 7.0 至 7. 2,或 7. 1 至 7.2 ;或 6.6 至 7. 1，或 6.7 至 7. 1，或 6.8 至 7. 1，或 6.9 至 7. 1，或 7. 0至7. 1，或6. 6至7. 0,或6. 7至7. 0,或6. 8至7. 0,或6. 9至7. 0之間的范圍。pH在第 一和/或第二培養(yǎng)溫度/時期可以保持在6. 8至7. 2,或6. 9至7. 2,或7. 0至7. 2,或7. 1 至 7. 2 ;或 6. 8 至 7. 3,或 6. 9 至 7. 3, 7. 0 至 7. 3,或 7. 1 至 7. 3,或 7. 2 至 7. 3,或 6. 8 至 7. 7， 或 6. 9 至 7. 7,或 7. 0 至 7. 7,或 7. 1 至 7. 7,或 7. 2 至 7. 7,或 7. 3 至 7. 7,或 7. 4 至 7. 7,或 7.5至7.7，或7.6至7.7之間的范圍。特別地，？!1可以是（約）6.8、6.9、7.0、7.1、7.2，或 這些值中的兩個的任何組合所定義的范圍內(nèi)。第一培養(yǎng)溫度/時期的PH和第二培養(yǎng)溫度 /時期的pH可以不同。
[0065] 光密度
[0066] 可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物的光密度將培養(yǎng)溫度從第一溫度降低到第二溫度。發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)根據(jù)光密度改變溫度對所表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量有額外的積極作用。發(fā)現(xiàn)當(dāng)600nm的OD 值在10和50之間時降低溫度時是有益的，在27和33之間是特別有益的。因此，本文描述 的方法可以包括測量光密度（OD)的步驟。當(dāng)600nm的光密度達(dá)到下列值時，可以將第一培 養(yǎng)溫度降低到第二培養(yǎng)溫度：10至50之間，或15至45之間，或20至40之間，或24至36 之間，或27至33之間。當(dāng)600nm的光密度達(dá)到下列值時，可以將第一培養(yǎng)溫度降低到第二 培養(yǎng)溫度：27至32之間，或27至31之間，或27至30之間，或27至29之間，或27至28之 間；或28至32之間，或28至31之間，或28至30之間，或28至29之間；或29至32之間， 或29至32之間，或29至31之間，或29至30之間，或30至32之間，或30至31之間，或 31至32之間。當(dāng)600nm的光密度達(dá)到下列值時，可以將第一培養(yǎng)溫度降低到第二培養(yǎng)溫 度：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35,或這些值中的兩個的任何組合所定義的密度。
[0067] 表達(dá)系統(tǒng)/載體/宿主細(xì)胞
[0068] 為了表達(dá)，重組多肽表達(dá)于宿主細(xì)胞中。因此，在一些實施方案中，在上面描述的 方法的步驟（a)、（b)和（c)之前可以將核酸導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞，其中所述核酸編碼感興趣 的重組多肽。該核酸可以作為載體的部分進(jìn)行導(dǎo)入。在一些實施方案中，該方法可以用已 經(jīng)含有所述重組核酸的宿主細(xì)胞進(jìn)行。
[0069] 各種適于在微生物細(xì)胞中重組表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是已知的?？梢?使用任何合適的表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)。"載體"或"表達(dá)載體"是多核酸構(gòu)建體，其是重組 生成的或合成的，具有一系列特定的多核酸元件，所述元件使宿主細(xì)胞中的特定核酸序列 可以轉(zhuǎn)錄核酸核酸。典型地，載體包括轉(zhuǎn)錄單元，該單元包含與啟動子可操作連接的待轉(zhuǎn)錄 的特定核酸序列。所述啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子，它能被外源刺激激活，例如添加藥物、 溫度等。載體通常包含"轉(zhuǎn)錄起始區(qū)"、"轉(zhuǎn)錄終止區(qū)"，還可以包含"增強(qiáng)子"。在宿主中可 表達(dá)的載體可以是例如自主或自我復(fù)制的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。適合的 載體實例包括 pBR322 (Fermentas)、pET300 載體、pDEST 載體和 pET39b 載體（Novagen)及 其衍生物。進(jìn)一步，適合的表達(dá)載體可以從實驗室手冊"Sambrook and Russel，Molecular Cloning-A Laboratory Manual? 3rd edition 2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring也!'13〇1'，階，0^口七61'15"獲得。在一些實施方案中，載體可以整合入宿 主細(xì)胞的基因組中，即整合性載體。在一些實施方案中，所述載體沒有整合入基因組并且在 細(xì)胞中保持獨立，即自主性或二元載體。
[0070] 本文使用的"啟動子"指的是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)的核酸序列。"啟動子區(qū)域"是調(diào) 節(jié)區(qū)域，其能結(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并且啟動下游（3'方向）編碼序列的轉(zhuǎn)錄。啟動子 區(qū)域通常包含負(fù)責(zé)與RNA多聚酶結(jié)合的蛋白結(jié)合區(qū)域（一致序列），例如公認(rèn)的-35盒和 Pribnow盒（-10盒）。進(jìn)一步地，啟動子區(qū)域可以包含轉(zhuǎn)錄起始位點和調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位 點。
[0071] "轉(zhuǎn)錄起始區(qū)"是促使轉(zhuǎn)錄起始并包含核糖體結(jié)合位點的序列的信號區(qū)域，例如 Shine Dalgarno序列。典型地，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游并且與要表達(dá)的核酸/ 基因可操作地連接。
[0072] "轉(zhuǎn)錄終止區(qū)"指的是使RNA多聚酶終止轉(zhuǎn)錄的序列。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)通常是轉(zhuǎn)錄單 元的一部分，其可以避免其他附近核酸/基因的不需要的轉(zhuǎn)錄或從其他潛在的啟動子的轉(zhuǎn) 錄，并且可以增加mRNA的穩(wěn)定性。
[0073] "增強(qiáng)子"是加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)錄的核酸序列，所述加強(qiáng)不依賴于轉(zhuǎn)錄單元的特性， 所述序列與轉(zhuǎn)錄單元的相對位置，或所述序列的方向。任選地，根據(jù)本發(fā)明可以使用的載體 可以包括增強(qiáng)子。
[0074] 當(dāng)將一個核酸序列置于與另一個核酸序列的功能性關(guān)系時，其是"可操作地連接" 的。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子與該序列可操作地連接；或者如果 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)例如核糖體結(jié)合位點是為了便于編碼例如多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄而進(jìn)行定位 的，則轉(zhuǎn)錄起始區(qū)與所述核酸可操作地連接核酸核酸?？梢酝ㄟ^在合適的限制性位點連接 (ligation)完成連接（linking)。
[0075] 本文涉及的"核酸"或"核酸序列"或"分離純化的核酸或核酸序列"可以是DNA、 RNA、或DNA/RNA雜合體。如果所述核酸或核酸序列位于載體中，則通常是DNA。本文涉及的 DNA可以是任意的多聚脫氧核糖核苷酸序列，包括例如雙鏈DNA、單鏈DNA、其中一或兩條鏈 由兩個或多個片段組成的雙鏈DNA、其中一或兩條鏈具有不中斷磷酸二酯骨架的雙鏈DNA、 含有一個或多個單鏈部分以及一個或多個雙鏈部分的DNA、其中所述DNA鏈完全互補(bǔ)的雙 鏈DNA、其中所述DNA鏈只有部分互補(bǔ)的雙鏈DNA、環(huán)狀DNA、共價閉合DNA、線性DNA、共價 交聯(lián)DNA、cDNA、化學(xué)合成的DNA、半合成DNA、生物合成的DNA、自然分離的DNA、酶解的DNA、 剪切的DNA、標(biāo)記的DNA(例如放射標(biāo)記的DNA以及熒光標(biāo)記的DNA)、含有一個或多個非天 然存在的種類或核酸的DNA。DNA序列可以通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)技術(shù)合成，例如，磷酸二酯方法 或通過自動化合成和PCR方法。純化并分離的DNA序列也可以是用酶技術(shù)生產(chǎn)的。本文涉 及的RNA可以是例如單鏈RNA、cRNA、雙鏈RNA、其中一或兩條鏈由兩個或多個片段組成的雙 鏈RNA、其中一或兩條鏈具有不中斷的磷酸二酯骨架的雙鏈RNA、含有一個或多個單鏈部分 以及一個或多個雙鏈部分的RNA、其中所述RNA鏈完全互補(bǔ)的雙鏈RNA、其中所述RNA鏈只 有部分互補(bǔ)的雙鏈RNA、共價交聯(lián)RNA、酶解的RNA、剪切的RNA、mRNA、化學(xué)合成的RNA、半合 成的RNA、生物合成的RNA、自然分離的RNA、標(biāo)記的RNA (例如放射標(biāo)記的RNA以及熒光標(biāo)記 的RNA)、含有一個或多個非天然存在的種類或核酸的RNA。
[0076] 所述表達(dá)系統(tǒng)可以是誘導(dǎo)式表達(dá)系統(tǒng)，即重組多肽的表達(dá)可以依賴于誘導(dǎo)物的存 在。編碼重組蛋白的核酸可以可操作地連接于具有誘導(dǎo)型啟動子的表達(dá)載體上?？梢酝ㄟ^ 例如添加或施用于細(xì)胞培養(yǎng)物直接提供相關(guān)的誘導(dǎo)物，或間接提供，即通過宿主細(xì)胞中的 第二構(gòu)建體?；谡T導(dǎo)，宿主細(xì)胞中的第二個構(gòu)建體可以產(chǎn)生信號以誘導(dǎo)所述核酸的表達(dá)。 所述第二構(gòu)建體可以是微生物宿主細(xì)胞的基因組的部分，或在所述細(xì)胞中自主維持。
[0077] 誘導(dǎo)式表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域所熟知的。已知的誘導(dǎo)物包括，例如IPTG、乳糖、NaCl、 溫度等。本文描述的方法中特別優(yōu)選的是用IPTG誘導(dǎo)。如果用IPTG作為誘導(dǎo)物，其使用 的濃度范圍可以從0,1mM至ImM，更優(yōu)選的是0. 2至0. 6mM，更優(yōu)選的是0. 25至0. 5mM，更優(yōu) 選的是0. 3至0. 35mM，更優(yōu)選的濃度是0. 33mM。
[0078] 在優(yōu)選的實施方案中，所述表達(dá)載體包括編碼重組多肽的核酸，