制劑包含F(xiàn)0XA2、F0XA3、HNFlAjP HNF4A。在其它實施方案中，所述蛋白質(zhì)制劑包含F(xiàn)0XA1、HNF1A、和HNF4A。在其它實施方案 中，所述蛋白質(zhì)制劑包含F(xiàn)0XA3、HNF1A、和HNF4A。在其它實施方案中，所述蛋白質(zhì)制劑包含 F0XA2、HNF1A、和HNF4A。在其它實施方案中，所述蛋白質(zhì)制劑包含F(xiàn)0XA1、F0XA3、和HNF1A。 在其它實施方案中，所述蛋白質(zhì)制劑包含F(xiàn)0XA1、F0XA2、和HNF1A。在其它實施方案中，所述 蛋白質(zhì)制劑包含F(xiàn)0XA2、F0XA3、和HNF1A。
[0023] 本發(fā)明還提供誘導(dǎo)肝細(xì)胞群，其中使用本文描述的任何方法和組合物獲得所述誘 導(dǎo)肝細(xì)胞。在一些實施方案中，本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群是均質(zhì)的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群。在 一些方面，本發(fā)明所提供的均質(zhì)的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群是其中顯著部分的細(xì)胞群包含誘導(dǎo)肝細(xì)胞 的細(xì)胞群，諸如，例如這樣的細(xì)胞群，其中群中多于約50%、多于約55%、多于約60%、多于 約65%、多于約70%、多于約75%、多于約80%、多于約85%、多于約90%、多于約91%、多 于約92%、多于約93%、多于約94%、多于約95%、多于約96%、多于約97%、多于約98%、 或多于約99%的細(xì)胞是通過本發(fā)明方法和組合物產(chǎn)生的誘導(dǎo)肝細(xì)胞。
[0024] 在其它方面，本發(fā)明還提供可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸 組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供可用于將人類非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為人類誘導(dǎo) 肝細(xì)胞的核酸組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編 程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中所述核酸制劑包含編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、 HNF1A、HNF4A、和GATA4的核酸分子。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì) 胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中所述核酸制劑包含編碼CEBPA、 GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、F0XA1、F0XA2、F0XA3、GATA4、HNF1A、和 HNF4A 的核酸分子。在 一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、和HNF4A 的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼F0XA1、F0XA3、HNF1A、 和HNF4A的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼F0XA1、F0XA2、 HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼F0XA2、 F0XA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼 F0XA1、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼 F0XA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼 F0XA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼 F0XA1、F0XA3、和HNF1A的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼 F0XA1、F0XA2、和HNF1A的核酸分子。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含編碼 F0XA2、F0XA3、和HNF1A的核酸分子。在某些實施方案中，編碼重編程因子的核酸分子是RNA 分子或mRNA分子。
[0025] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝 細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中所述核酸制劑包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:33的核酸序列、含有SEQ ID N0:35的核酸序列、含有SEQ ID N0:37的核酸序列、含有 SEQ ID N0:39的核酸序列、SEQ ID N0:41的核酸序列、和含有SEQ ID N0:43的核酸序列。在 一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:33 的核酸序列、含有SEQ ID N0:35的核酸序列、含有SEQ ID N0:37的核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸序列、和含有SEQ ID N0:41的核酸序列。在一些實施方案中，包含核酸制劑的 組合物包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:33的核酸序列、含有SEQ ID N0:37的 核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸序列、和含有SEQ ID N0:41的核酸序列。在一些實施 方案中，包含核酸制劑的組合物包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:33的核酸序 列、含有SEQ ID N0:35的核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸序列、和含有SEQ ID N0:41 的核酸序列。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含這樣的核酸分子，其包含含 有SEQ ID N0:35的核酸序列、含有SEQ ID N0:37的核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸 序列、和含有SEQ ID N0:41的核酸序列。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含 這樣的核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:33的核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸序列、 和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含這樣的 核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:37的核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸序列、和含有 SEQ ID N0:41的核酸序列。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含這樣的核酸分 子，其包含含有SEQ ID N0:35的核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO: 41的核酸序列。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含這樣的核酸分子，其包 含含有SEQ ID N0:33的核酸序列、含有SEQ ID N0:37的核酸序列、和含有SEQ ID N0:39 的核酸序列。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含這樣的核酸分子，其包含含有 SEQ ID NO: 33的核酸序列、含有SEQ ID NO: 35的核酸序列、和含有SEQ ID NO: 39的核酸序 列。在一些實施方案中，包含核酸制劑的組合物包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:35的核酸序列、含有SEQ ID N0:37的核酸序列、和含有SEQ ID N0:39的核酸序列。
[0026] 在本文所提供方法的多個方面，所述非肝細(xì)胞的細(xì)胞是人類非肝細(xì)胞的細(xì)胞，并 且所得到的誘導(dǎo)肝細(xì)胞是人類誘導(dǎo)肝細(xì)胞。在本文所提供方法的一些方面，所述非肝細(xì)胞 的細(xì)胞不是干細(xì)胞。在本文所提供方法的其它方面，所述非肝細(xì)胞的細(xì)胞不是多能細(xì)胞。在 本文所提供方法的再其它方面，所述非肝細(xì)胞的細(xì)胞是體細(xì)胞，包括人類體細(xì)胞。
[0027] 在多個方面，通過本發(fā)明方法獲得的誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞基因，包括白蛋白、甲 胎蛋白、1-抗胰蛋白酶、細(xì)胞角蛋白18和S樣蛋白1。
[0028] 本發(fā)明還提供包含通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞組合物。在一些實施 方案中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)肝細(xì)胞的多種組合物，例如實質(zhì)上沒有肝細(xì)胞以外的細(xì)胞的細(xì)胞 培養(yǎng)物或細(xì)胞群。此外提供了組合物，例如經(jīng)富集、分離或純化肝細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞 群。
[0029] 本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)肝細(xì)胞組合物可包含誘導(dǎo)肝細(xì)胞的均質(zhì)群體。在一些方面， 本發(fā)明提供包含誘導(dǎo)肝細(xì)胞的組合物，其中所述組合物包含誘導(dǎo)肝細(xì)胞的均質(zhì)群體。在 一些實施方案中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)肝細(xì)胞的組合物，其中在所述組合物內(nèi)細(xì)胞的百分比包 含約 1 %、約 5%、約 10%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、 約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%的誘導(dǎo)肝細(xì)胞。在一些實施方 案中，包含誘導(dǎo)肝細(xì)胞的組合物中的細(xì)胞百分比為100%。
[0030] 本發(fā)明提供可用于多種研宄和治療應(yīng)用的誘導(dǎo)肝細(xì)胞或誘導(dǎo)肝細(xì)胞群。在一些實 施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞被用作多種人類疾病和病癥的模型。在其它實施方案中，本 發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞被用作肝炎和其它肝病研宄的模型。本發(fā)明提供誘導(dǎo)肝細(xì)胞，其可用于 治療多種退行性肝病或肝功能的遺傳性或獲得性缺陷。例如，本發(fā)明提供對有需要的患者 提供基于細(xì)胞的療法的方法，通過對所述患者施用經(jīng)本文所公開的方法獲得的誘導(dǎo)肝細(xì)胞 群體。在某些實施方案中，所述有需要的患者患有肝病或肝病癥，例如肝纖維化、硬化、肝衰 竭、肝炎、肝癌等。
[0031] 本發(fā)明還提供使用經(jīng)本文所述的方法獲得的誘導(dǎo)肝細(xì)胞就毒性（例如肝臟毒性） 對藥物候選物進(jìn)行篩選的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供就毒性或肝臟毒性對藥物 候選物進(jìn)行篩選的方法，其通過使誘導(dǎo)肝細(xì)胞群與藥物候選物接觸并就毒性或肝臟毒性監(jiān) 測誘導(dǎo)肝細(xì)胞，從而鑒定所述藥物候選物是否是毒性的。
[0032] 本發(fā)明還提供重編程細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述重編程細(xì)胞培養(yǎng)基包含DMEM/ ?12+61此 &111&1培養(yǎng)基，10%胎牛血清$85)，1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒，1%1^11非必需氨基 酸，5mM HEPES緩沖液，20ng/ml人類肝細(xì)胞生長因子（HGF)，20ng/ml表皮生長因子（EGF)， 20ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)，200ng/mL B18R和0. 1 yM地塞米松。在本發(fā)明方法 的多個方面，在適合于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的條件下培養(yǎng)非肝細(xì)胞的細(xì) 胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)基是上述的重編程培養(yǎng)基。
[0033] 在其它方面，本發(fā)明提供鑒定促進(jìn)非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的因子的 方法。 附圖簡介
[0034] 圖1列出的數(shù)據(jù)顯示在用多種量的編碼GFP或核GFP的mRNA轉(zhuǎn)染的人新生兒包 皮成纖維細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP)和核GFP(NLS GFP)的表達(dá)和細(xì)胞定位。
[0035] 圖2列出的數(shù)據(jù)顯示，重編程因子表達(dá)在用編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF4A、 HNF1A和GATA4的mRNA的混合物每日轉(zhuǎn)染持續(xù)9天的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中得以維 持。
[0036] 圖3列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼？(》41、？(《42、？(《43、圓?44、圓?認(rèn)和64了44的1111?隱 的混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF4A、HNF1A和GATA4 的蛋白質(zhì)表達(dá)和核定位。
[0037] 圖4列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼？(》41、？(《42、？(《43、圓?44、圓?認(rèn)和64了44的1111?隱 的混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中白蛋白和甲胎蛋白（AFP)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0038] 圖5列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼？(》41、？(《42、？(《43、圓?44、圓?認(rèn)和64了44的1111?隱 的混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中F0XA2蛋白質(zhì)表達(dá)和核定位與甲胎蛋白（AFP) 表達(dá)和胞質(zhì)定位相關(guān)聯(lián)。
[0039] 圖6列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼？(》41、？(《42、？(《43、圓?認(rèn)、圓?44和64了44的1111?隱 的混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中白蛋白蛋白質(zhì)表達(dá)和適當(dāng)?shù)陌|(zhì)定位。
[0040] 圖7列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的 mRNA的混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中a 1-抗胰蛋白酶（A1AT)、細(xì)胞角蛋白 18(CK18)和S樣蛋白1(DLK1)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0041] 圖8列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼？(》41、？(《42、？(《43、圓?認(rèn)、圓?44和64了44的1111?隱 的混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中的雙成核（bi-nucleation)。
[0042] 圖 9 列出的數(shù)據(jù)顯示用編碼 F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、HNF4A 和 GATA4 的 mRNA 的混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中的脂微滴。
[0043] 圖10列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的 mRNA的混合物轉(zhuǎn)染的人胎兒肺成纖維細(xì)胞中白蛋白和甲胎蛋白（AFP)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0044] 圖11A和11B列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、HNF4A和 GATA4的mRNA的多種混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中白蛋白和甲胎蛋白（AFP)基 因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0045] 圖12A和12B列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A和HNF4A的 mRNA的多種混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中白蛋白和甲胎蛋白（AFP)基因表達(dá) 的誘導(dǎo)。
[0046] 圖13A和13B列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼F0XA1、F0XA3、HNF1A和HNF4A的mRNA的 多種混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中白蛋白和甲胎蛋白（AFP)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0047]圖14A和14B列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼HNF1A的mRNA和用編碼F0XA1、F0XA2、 F0XA3、HNF4A或GATA4的mRNA轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維細(xì)胞中白蛋白和甲胎蛋白（AFP) 基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0048] 圖15列出人F0XA1的核酸序列（SEQIDN0:33)。
[0049] 圖16列出人F0XA1的氨基酸序列（SEQ ID NO: 34)。
[0050] 圖17列出人F0XA2的核酸序列（SEQ ID NO: 35)。
[0051] 圖18列出人F0XA2的氨基酸序列（SEQIDNO: 36)。
[0052] 圖19列出人F0XA3的核酸序列（SEQ ID NO: 37)。
[0053] 圖20列出人F0XA3的氨基酸序列（SEQ ID NO: 38)。
[0054] 圖21列出人HNF1A的核酸序列（SEQ ID NO: 39)。
[0055] 圖22列出人HNF1A的氨基酸序列（SEQ ID NO:40)。
[0056] 圖23列出人HNF4A的核酸序列（SEQ ID NO:41)。
[0057] 圖24列出人HNF4A的氨基酸序列（SEQIDNO:42)。
[0058] 圖25列出人GATA4的核酸序列（SEQ ID NO:43)。
[0059] 圖26列出人GATA4的氨基酸序列（SEQ ID NO:44)。
[0060] 圖 27 列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼 C/EBP a、F0XA1、F0XA2、F0XA3、GATA4、GATA6、 HHEX、HNF1A、HNF1B、HNF4A和HNF6A的mRNA的混合物轉(zhuǎn)染的人胎兒肺成纖維細(xì)胞中白蛋白 和甲胎蛋白（AFP)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0061] 圖 28 列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼 C/EBP a、F0XA1、F0XA2、F0XA3、GATA4、GATA6、 11昍乂、11嚦認(rèn)、11嚦18、11嚦44和11嚦64的1111?隱的混合物（11了?）或用編碼？(《41、？(《42、？(《八3、 HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物（6TF)轉(zhuǎn)染的人胎兒肺成纖維細(xì)胞中白蛋白和甲 胎蛋白（AFP)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0062] 圖29A和29B列出的數(shù)據(jù)顯示與在原代肝細(xì)胞中所觀察的相比較，在用編碼 F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物轉(zhuǎn)染的人新生兒包皮成纖維 細(xì)胞（圖29A)和人胎兒肺成纖維細(xì)胞（圖29B)中多種肝細(xì)胞基因的表達(dá)水平。
[0063] 圖30列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的 mRNA的混合物轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞中多種細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)水平。
[0064] 圖 31 列出的數(shù)據(jù)顯示在用編碼 C/EBP a、F0XA1、F0XA2、F0XA3、GATA4、GATA6、 11昍乂、11嚦認(rèn)、11嚦18、11嚦44和11嚦64的1111?隱的混合物（11了?）或用編碼？(《41、？(《42、？(《八3、 HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物（6TF)轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞中多種濃度的地塞米 松對白蛋白基因表達(dá)的影響。
[0065] 圖32列出的數(shù)據(jù)顯示編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的多種轉(zhuǎn) 錄因子在人成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的轉(zhuǎn)錄因 子的表達(dá)的能力。
[0066] 圖33列出的數(shù)據(jù)顯示與在人肝細(xì)胞中所觀察的相比較，用編碼F0XA1、F0XA2、 F0XA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的轉(zhuǎn)錄因子的多種組合轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞的基因簇分析。
[0067] 圖34A和34B列出的數(shù)據(jù)顯示與在原代肝細(xì)胞中所觀察的相比較，在分別用6TF mRNA混合物轉(zhuǎn)染的人胎兒成纖維細(xì)胞和在人胚胎干細(xì)胞中33種肝細(xì)胞基因的基因表達(dá)水 平。
[0068] 圖35A和35B列出的數(shù)據(jù)顯示經(jīng)RNA測序得到的全局基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)相似性和全 局小RNA表達(dá)相似性的比較，其分別制圖為用6TF mRNA混合物、11TF mRNA混合物和載體對 照轉(zhuǎn)染的人胎兒成纖維細(xì)胞的l〇g2比率。
[0069] 圖36列出的數(shù)據(jù)顯示在用6TF mRNA混合物轉(zhuǎn)染的人胎兒肝細(xì)胞中高于載體處理 的對照細(xì)胞的前25種上調(diào)基因的log2比率（紅色，肝相關(guān)基因；藍(lán)色，其它內(nèi)胚層基因；綠 色，組蛋白基因）。
[0070] 圖37列出的數(shù)據(jù)顯示與在載體處理的對照細(xì)胞中所觀察的相比較，在用6TF mRNA混合物轉(zhuǎn)染的人胎兒成纖維細(xì)胞中組蛋白的上調(diào)，其制圖為RPKM log2。
[0071] 圖38列出的數(shù)據(jù)顯示在用6TF mRNA混合物轉(zhuǎn)染的人胎兒成纖維細(xì)胞中較之對照 上調(diào)或下調(diào)超過2倍的組織特異性基因的log2比率。
[0072] 發(fā)明詳述
[0073] 本發(fā)明提供尤其是可用于非肝細(xì)胞的細(xì)胞到誘導(dǎo)肝細(xì)胞的高效重編程的方法和 組合物、誘導(dǎo)肝細(xì)胞群、包含誘導(dǎo)肝細(xì)胞的組合物以及其用途。本文描述的方法和組合物可 用于高效率地將起始細(xì)胞群（例如，非肝細(xì)胞的細(xì)胞群）重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞群體。本發(fā) 明還包含這樣的組合物，其包含編碼可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的重編 程因子的核酸。本發(fā)明還包含這樣的組合物，其包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘 導(dǎo)肝細(xì)胞的重編程因子多肽。在多個方面，非肝細(xì)胞的細(xì)胞來源于人，并且誘導(dǎo)肝細(xì)胞是人 類誘導(dǎo)肝細(xì)胞。
[0074] 應(yīng)當(dāng)理解，提及本文所述的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群考慮并且包括分離的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群。
[0075] 一般方法
[0076] 除非另外指明，本發(fā)明的實踐將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉且可得的細(xì)胞生物 學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)（包括重組技術(shù)）、微生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技 術(shù)。這些技術(shù)記載于文獻(xiàn)中，例如MolecularCloning:AlaboratoryManual,第三版 (Sambrook等人,2001)ColdSpringHarborPress；01igonucleotideSynthesis(P. Herdewijn,編輯，2004);AnimalCellCulture?.I.Freshney,編輯，1987);Methods inEnzymology(AcademicPress,Inc. )；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F. M.Ausubel等人，編輯，1987) ;PCR:ThePolymeraseChainReaction(Mullis等人，編 輯，1994);CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan等人，編輯，1991);以及 ShortProtocolsinMolecularBiology(Wiley和 Sons, 1999)〇
[0077] 除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。
[0078] 定義
[0079] 術(shù)語"非