胞。
[0143] 本文使用的直接或間接激活可以這樣發(fā)生，其中活性劑或活性劑的組合誘導(dǎo)、 激活或提高本文所述重編程因子中的一種或多種的表達(dá)或活性（即，誘導(dǎo)、激活或提高 ?0父八1、？(《42、？(《43、11即認(rèn)、11即44、和64144中的一種或多種的表達(dá)或活性）。這樣的直接 或間接激活可以通過使非肝細(xì)胞的細(xì)胞與一種或多種有效誘導(dǎo)、激活或提高F0XA1、F0XA2、 ?0父八3、11即認(rèn)、11即44、和64144中的一種或多種的表達(dá)或活性的活性劑接觸而進(jìn)行。這樣的 活性劑可包括調(diào)節(jié)重編程因子的表達(dá)或活性的任何活性劑例如小分子、生長因子和其它活 性劑。
[0144] 最近的報(bào)道顯示，小分子kenpaullone有效地將鼠成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能 細(xì)胞，基本上代替重編程因子Klf4(參見Lyssiotis等人，（2009) PNAS 106:8912-8917)。 該報(bào)道表明，可以鑒定有效地將一種分化狀態(tài)的細(xì)胞重編程為另一分化狀態(tài)的非轉(zhuǎn)錄因子 的活性劑。本發(fā)明提供鑒定一種或多種能夠直接或間接使非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝 細(xì)胞的活性劑的方法。對(duì)于這些方法中的每一者，將非肝細(xì)胞的細(xì)胞的起始細(xì)胞培養(yǎng)物或 細(xì)胞群體與一種或多種候選活性劑接觸，并就重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞監(jiān)測(cè)細(xì)胞或細(xì)胞群（例 如，通過檢測(cè)、測(cè)量或定量指示誘導(dǎo)肝細(xì)胞的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)、活性或表型變化）。確定一 種或多種候選活性劑是否能影響非肝細(xì)胞的細(xì)胞向誘導(dǎo)肝細(xì)胞的直接或間接重編程（或 分化）的其它方法此前已有記載（參見，例如，W0 2007/127454)。
[0145] 肝細(xì)朐群
[0146] 本發(fā)明還提供誘導(dǎo)肝細(xì)胞群，其中使用本文描述的任何方法和組合物獲得所述誘 導(dǎo)肝細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群是均質(zhì)的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群。在一 些方面，本發(fā)明所提供的均質(zhì)的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群是其中顯著部分的細(xì)胞群包含誘導(dǎo)肝細(xì)胞的 細(xì)胞群。本文使用的顯著部分是指這樣的細(xì)胞群，其中群中多于約50%、多于約55%、多于 約60%、多于約65%、多于約70%、多于約75%、多于約80%、多于約85%、多于約90%、多 于約91%、多于約92%、多于約93%、多于約94%、多于約95%、多于約96%、多于約97%、 多于約98%、或多于約99%的細(xì)胞是誘導(dǎo)肝細(xì)胞。
[0147] 在一些情況下，令人合意的是從包含非肝細(xì)胞的細(xì)胞和誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞群富集 誘導(dǎo)肝細(xì)胞?？梢酝ㄟ^領(lǐng)域內(nèi)熟知的多種富集細(xì)胞的技術(shù)和方法從非肝細(xì)胞的細(xì)胞和誘導(dǎo) 肝細(xì)胞的混合物中富集本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞。例如，可以使用細(xì)胞分選方法例如熒光激活 細(xì)胞分選（FACS)來有效富集誘導(dǎo)肝細(xì)胞。
[0148] 任意一種或多種的肝細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志物的存在可以用于自非肝細(xì)胞的細(xì)胞群中區(qū) 分、鑒定和富集通過本發(fā)明方法獲得的誘導(dǎo)肝細(xì)胞或誘導(dǎo)肝細(xì)胞群?？梢允褂妙I(lǐng)域內(nèi)已 知且可得的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)肝細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志物，這些方法包括但不限于，免疫組化、流式細(xì)胞 術(shù)、焚光成像、PCR、Western印跡、Northern印跡等。例如，多種肝細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志物可以是在 誘導(dǎo)肝細(xì)胞上表達(dá)但不在非肝細(xì)胞的細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，或?qū)τ诟渭?xì)胞系細(xì)胞 特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志物。細(xì)胞表面肝細(xì)胞標(biāo)志物包括，例如E-鈣黏著蛋白、DLK1、⑶133 等。肝細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的（參見，例如，http://www. stembook.org/ node/512)?？梢栽诩?xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)或在將重編程因子（或編碼重編程因子的核酸） 弓丨入到非肝細(xì)胞的細(xì)胞中之后，例如在一輪或多輪轉(zhuǎn)染之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、 7天、8天、9天、10天或更久，測(cè)量肝細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志物。
[0149] 對(duì)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可以將誘導(dǎo)肝細(xì)胞富集、分離或純化以用于多種研 宄和治療應(yīng)用。例如，可以通過使包括本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞群與試劑接觸，并從試劑 未結(jié)合的細(xì)胞中分離試劑結(jié)合的細(xì)胞，來富集、分離或純化本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞，所述試劑 與在誘導(dǎo)肝細(xì)胞中或在其上表達(dá)但在非肝細(xì)胞的細(xì)胞中或在其上實(shí)質(zhì)上不表達(dá)的標(biāo)志物 結(jié)合或者與之相互作用。在富集、分離或純化誘導(dǎo)肝細(xì)胞的一些實(shí)施方案中，標(biāo)志物可以是 在誘導(dǎo)肝細(xì)胞中或在其上表達(dá)但在非肝細(xì)胞的細(xì)胞中或在其上實(shí)質(zhì)上不表達(dá)的任何標(biāo)志 物。這些標(biāo)志物包括但不限于，白蛋白、甲胎蛋白、a 1-抗胰蛋白酶、細(xì)胞角蛋白18、DLK1、 CD133、N-鈣黏著蛋白（NCAD)等。
[0150] 使用本文所述方法獲得的任何誘導(dǎo)肝細(xì)胞群可以以誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞庫的形式 低溫保存?？梢詫⑦@些細(xì)胞庫解凍用于后續(xù)治療或?qū)嶒?yàn)用途。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且 可得的方法可以將本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞庫制備成低溫存儲(chǔ)物和將其低溫存儲(chǔ)。
[0151] 核酸組合物
[0152] 本發(fā)明還提供可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸組合物。在一 些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可用于將人類非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為人類誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸 組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì) 胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、HNF4A、和 GATA4的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程 為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含編碼CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、 圓?6八、？(》41、？(《42、？(《43、64144、圓?認(rèn)、和圓?44的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核 酸制劑包含編碼F0XA1、F0XA2、F0XA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中 該核酸制劑包含編碼F0XA1、F0XA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子；或者，其中該核酸制劑包 含編碼F0XA1、F0XA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分子；或者其中該核酸制劑包含編碼F0XA2、 F0XA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝 細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含編碼F0XA1、 HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì) 胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含編碼F0XA3、HNF1A、和 HNF4A的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為 誘導(dǎo)肝細(xì)胞核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含編碼F0XA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分 子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的 核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含編碼F0XA1、F0XA3、和HNF1A的核酸分子。在一些 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的 組合物，其中該核酸制劑包含編碼F0XA1、F0XA2、和HNF1A的核酸分子。在一些實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中 該核酸制劑包含編碼F0XA2、F0XA3、和HNF1A的核酸分子。在多個(gè)實(shí)施方案中，可用于將非 肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸分子是RNA分子、mRNA分子、DNA分子、cDNA分 子等。在特定的實(shí)施方案中，編碼以上鑒定的重編程因子的核酸分子是純化的或?qū)嵸|(zhì)上純 化的核酸分子。在其它特定實(shí)施方案中，該核酸分子包含修飾的核苷酸或修飾的核苷，例如 使用修飾的核苷例如甲基-CTP和假-UTP轉(zhuǎn)錄的mRNA分子。用于制備修飾的RNA分子的 方法以前已有記載（參見，例如，國際申請(qǐng)公開第W0 2011/071931號(hào)和第W0 2007/024708 號(hào)，和美國申請(qǐng)公開第US 2009/0286852號(hào)，其內(nèi)容整體地并入本文以作參考）。
[0153] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì) 胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:33 的核酸序列、含有SEQ ID N0:35的核酸序列、含有SEQ ID N0:37的核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸序列、SEQ ID N0:41的核酸序列、和含有SEQ ID N0:43的核酸序列。在一些 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的 組合物，其中該核酸制劑包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ ID N0:33的核酸序列、含 有SEQ IDN0:35的核酸序列、含有SEQ IDN0:37的核酸序列、含有SEQ IDN0:39的核酸 序列、和含有SEQ IDN0:41的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非 肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含這樣的核酸 分子，其包含含有SEQ IDNO:33的核酸序列、含有SEQ IDNO:37的核酸序列、含有SEQ ID N0:39的核酸序列、和含有SEQ IDN0:41的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含 可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含 這樣的核酸分子，其包含含有SEQ IDN0:33的核酸序列、含有SEQ IDN0:35的核酸序列、 含有SEQ IDN0:39的核酸序列、和含有SEQ IDN0:41的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該 核酸制劑包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ IDN0:35的核酸序列、含有SEQ IDN0:37 的核酸序列、含有SEQ IDN0:39核酸序列、和含有SEQ IDN0:41的核酸序列。在一些實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合 物，其中該核酸制劑包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ IDN0:33的核酸序列、含有SEQ IDN0:39的核酸序列、和含有SEQ IDN0:41的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供 包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑 包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ IDNO: 37的核酸序列、含有SEQ IDNO: 39的核酸序 列、和含有SEQ IDN0:41的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝 細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含這樣的核酸分 子，其包含含有SEQ IDN0:35的核酸序列、含有SEQ IDN0:39的核酸序列、和含有SEQ ID N0:41的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程 為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物，其中該核酸制劑包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ IDNO:33的核酸序列、含有SEQ IDNO:37的核酸序列、和含有SEQ IDNO:39的核酸序列。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸 制劑的組合物，其中該核酸制劑包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ IDN0:33的核酸序 列、含有SEQ IDN0:35的核酸序列、和含有SEQ IDN0:39的核酸序列。在一些實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供包含可用于將非肝細(xì)胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸制劑的組合物， 其中該核酸制劑包含這樣的核酸分子，其包含含有SEQ IDN0:35的核酸序列、含有SEQ ID NO: 37的核酸序列、和含有SEQ IDNO: 39的核酸序列。在多個(gè)實(shí)施方案中，可用于將非肝細(xì) 胞的細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的核酸是編碼重編程因子的DNA分子或mRNA分子，優(yōu)選是純 化的DNA分子或純化的mRNA分子。
[0154] 誘導(dǎo)肝細(xì)朐的表征和鑒宙
[0155] 可以根據(jù)多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞進(jìn)行表征和鑒定。這些標(biāo)準(zhǔn)包括但不限 于，對(duì)表達(dá)的肝細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志物、酶活性、肝細(xì)胞功能的檢測(cè)或定量、肝細(xì)胞形態(tài)特征的表 征等。在一些方面，待重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的非肝細(xì)胞的細(xì)胞可以含有包含肝細(xì)胞特異性 轉(zhuǎn)錄控制元件例如肝細(xì)胞特異性基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因，其可以用于鑒定誘導(dǎo)肝細(xì)胞。
[0156] 在某些方面，本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞具有肝細(xì)胞特征性的形態(tài)特征，例如在來源于 器官來源的原代肝細(xì)胞中所觀察到的。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知曉肝細(xì)胞特征性的形態(tài)特 征，并且可包括任何或所有以下特征：多邊形細(xì)胞形狀、雙成核表型、用于分泌型蛋白質(zhì)合 成的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的存在、相對(duì)豐富或廣泛的液泡、脂滴、用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分選的高爾基 體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶酶體復(fù)合物的存在、過氧化物酶體和糖原儲(chǔ)存顆粒的存在、相對(duì)豐富的線粒 體以及形成緊密的細(xì)胞間連接導(dǎo)致膽汁微管空間產(chǎn)生的能力。單細(xì)胞中存在的這些形態(tài)特 征中的一種或多種與作為肝細(xì)胞系之一的細(xì)胞相一致。本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞可具有肝細(xì)胞 特征性的這些形態(tài)特征中的任意一種或多種，并且因此可以根據(jù)這些形態(tài)特征中的任意一 種或多種進(jìn)行表征或鑒定。
[0157] 在其它方面，本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞可以根據(jù)肝細(xì)胞特征性的多種表型標(biāo)志物的表 達(dá)或誘導(dǎo)進(jìn)行表征或鑒定。肝細(xì)胞特征性的并且可用于鑒定誘導(dǎo)肝細(xì)胞的表型標(biāo)志物的非 限制性實(shí)例包括，例如白蛋白、甲胎蛋白、a 1-抗胰蛋白酶、細(xì)胞角蛋白18和DLK1。肝細(xì)胞 特征性的表型標(biāo)志物的其它實(shí)例包括色氨酸2, 3-加雙氧酶（Td〇2)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、E-鈣黏著 蛋白、緊密連接蛋白（Tjpl)、脫唾液酸糖蛋白受體、apoE、精氨酸酶l、apoAI、apoAII、apoB、 apoCIII、apoCII、醛縮酶B、醇脫氫酶1、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸酶、y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、 尿素產(chǎn)生、甘油三酯合成、細(xì)胞色素P450活性等。本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞可以具有肝細(xì)胞特 征性的這些表型標(biāo)志物中的任意一種或多種，并且因此可基于這些表型標(biāo)志物中的任意一 種或多種的表達(dá)或活性進(jìn)行表征或鑒定。
[0158] 在一些實(shí)施方案中，通過檢測(cè)標(biāo)志物的存在或活性，或者在一些情況下檢測(cè)標(biāo)志 物的不存在，來確定某些標(biāo)志物的表達(dá)?？梢酝ㄟ^檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞或多 個(gè)細(xì)胞內(nèi)的、其表面上的、或由其分泌的標(biāo)志物的存在，來確定肝細(xì)胞特征性的標(biāo)志物的表 達(dá)。檢測(cè)可以是定量的或定性的。可以通過任何合適的免疫學(xué)方法來確定蛋白質(zhì)表達(dá)，例 如，流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、Western印跡分析、酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA)等。
[0159] 可以通過PCR(包括定量PCR、實(shí)時(shí)PCR等）、Northern印跡分析、原位雜交等來確 定肝細(xì)胞標(biāo)志物的基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并且可得到執(zhí)行這些技術(shù)的方法。也可 以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的其它方法對(duì)肝細(xì)胞標(biāo)志物基因表達(dá)進(jìn)行定量。例如，可以通過使用對(duì) 于目的標(biāo)志物基因產(chǎn)物特異性的抗體來檢測(cè)標(biāo)志物基因產(chǎn)物的表達(dá)?？梢允褂煤怂犭s交或 擴(kuò)增技術(shù)來檢測(cè)一種或多種肝細(xì)胞標(biāo)志物的存在、不存在、和/或表達(dá)水平。核酸雜交技術(shù) 包括，例如，Northern印跡、狹縫印跡（slot blot)、RNA酶保護(hù)、原位雜交等。核酸擴(kuò)增技 術(shù)包括PCR、實(shí)時(shí)PCR、定量PCR等。用于檢測(cè)和定量特定核酸的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員 是熟知的，并且描述于例如Ausubel等（參見，例如國際申請(qǐng)公開第W0 2007/127454號(hào)） 中。
[0160] 在某些方面，確定肝細(xì)胞特征性的標(biāo)志物基因的表達(dá)以及非肝細(xì)胞的細(xì)胞（例 如，成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等）特征性的標(biāo)志物基因的顯著表達(dá)的缺乏。
[0161] 包含誘導(dǎo)肝細(xì)朐的組合物
[0162] 本發(fā)明提供包含通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞組合物。在一些實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)肝細(xì)胞的多種組合物，例如實(shí)質(zhì)上沒有肝細(xì)胞以外的細(xì)胞的細(xì)胞培 養(yǎng)物或細(xì)胞群。此外，提供對(duì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞進(jìn)行富集、分離或純化的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物 或細(xì)胞群。
[0163] 本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的組合物可包含均質(zhì)的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群。在一些方面， 本發(fā)明提供包含誘導(dǎo)肝細(xì)胞的組合物，其中該組合物包含均質(zhì)的誘導(dǎo)肝細(xì)胞群。在一些 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)肝細(xì)胞的組合物，其中組合物內(nèi)的細(xì)胞百分比包含約1 %、約 5%、約 10%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、 約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約96%、約97%、約98%、或約99%誘導(dǎo)肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，包含誘導(dǎo)肝細(xì) 胞的組合物中細(xì)胞的百分比是100 %誘導(dǎo)肝細(xì)胞。
[0164] 伸用誘導(dǎo)肝細(xì)朐的方法
[0165] 本發(fā)明提供可用于多種研宄和治療應(yīng)用的誘導(dǎo)肝細(xì)胞或誘導(dǎo)肝細(xì)胞群體。這些 應(yīng)用包括誘導(dǎo)肝細(xì)胞在體內(nèi)的移植或植入；體外篩選細(xì)胞毒性化合物、致癌物、誘變劑、生 長/調(diào)節(jié)因子、藥物化合物等；解釋多種肝臟疾病和肝臟感染的機(jī)制；產(chǎn)生生物學(xué)活性產(chǎn)物 等。例如，本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞可以用于細(xì)胞和組織分化的進(jìn)一步研宄。本文所述的誘導(dǎo) 肝細(xì)胞還可以用于測(cè)試新藥物和治療候選物的毒性測(cè)定中。并且，本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞可 以用于再生醫(yī)學(xué)和治療用途。
[0166] 本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞可以用于篩選可能影響本文所提供的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的多種特 性的多種因素（例如溶劑、治療劑、肽和多核苷酸）或環(huán)境條件（例如培養(yǎng)條件或操作）。
[0167] 在一些方面，本發(fā)明的多種篩選應(yīng)用涉及藥物研宄中對(duì)藥物化合物或活性劑的測(cè) 試（參見，例如，Castell 等人，In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press，1997 ;和美國專利第5, 030, 015號(hào)）。在某些方面，本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞可用于標(biāo)準(zhǔn) 藥物篩選和毒性測(cè)試，如以前已對(duì)肝細(xì)胞細(xì)胞系或原代肝細(xì)胞所進(jìn)行的。候選藥物化合物 或活性劑的活性評(píng)價(jià)一般涉及到將誘導(dǎo)肝細(xì)胞與候選化合物組合，確定歸因于化合物或活 性劑的細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)志物表型或代謝活性的任何變化（與未經(jīng)處理的細(xì)胞或用惰性化合物 或惰性劑處理的細(xì)胞相比），然后將化合物或活性劑的效果與所觀察的變化相關(guān)聯(lián)。篩選 可以因化合物或活性劑被設(shè)計(jì)為對(duì)肝細(xì)胞具有藥理學(xué)作用、或因化合物或活性劑可被設(shè)計(jì) 為具有其他作用（例如，被設(shè)計(jì)為對(duì)非肝細(xì)胞的細(xì)胞有作用）而進(jìn)行，并因此可能具有非預(yù) 期的肝細(xì)胞副作用?？梢越M合測(cè)試兩種或更多種化合物或活性劑（例如，兩種或更多種藥 物）（通過同時(shí)或順序地與誘導(dǎo)肝細(xì)胞組合），來檢測(cè)可能的藥物-藥物相互作用效果。
[0168] 在一些方面，本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞可用于就潛在的細(xì)胞毒性或肝臟毒性篩選化合 物（參見Castell等人，（1997)見上文）?？赏ㄟ^化合物對(duì)細(xì)胞生存力、存活、形態(tài)以及酶 和其它因子滲漏到培養(yǎng)基中的效果、或通過確定化合物對(duì)肝細(xì)胞功能的效果（諸如，例如， 對(duì)糖異生、尿素生成、血漿蛋白質(zhì)合成等）來確定細(xì)胞毒性或肝臟毒性。
[0169] 評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性或肝臟毒性的其它方法包括確定化合物對(duì)白蛋白、膽固醇和脂蛋白 合成和分泌；綴合膽汁酸和膽紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)；尿素生成；細(xì)胞色素P450水平和活性；谷胱甘 肽水平；a-谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶的釋放；ATP、ADP和AMP代謝；細(xì)胞內(nèi)K+和Ca2+濃度；核基 質(zhì)蛋白質(zhì)或寡核小體（oligonucleosome)的釋放；和凋亡誘導(dǎo)的作用?；衔飳?duì)DNA合成 或結(jié)構(gòu)的作用可以通過測(cè)量DNA合成或修復(fù)來加以確定。
[0170] 本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞還可以用作藥物測(cè)試和開發(fā)過程的工具。例如，可使用細(xì)胞 來評(píng)定考慮開發(fā)的藥物候選物（例如，治療藥物候選物）所引起的基因表達(dá)譜的變化?？?以將潛在藥物引起的基因表達(dá)譜變化與已知影響肝臟的對(duì)照藥物引起的情形相比較。這樣 使人們可以就化合物和藥物早期在藥物開發(fā)過程中對(duì)肝臟的效果對(duì)其進(jìn)行篩選而不使用 動(dòng)物，從而節(jié)省時(shí)間和金錢。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞用于高通量的藥物篩 選，例如以美國專利第7, 282, 366號(hào)中記載的方式。
[0171] 本發(fā)明的誘導(dǎo)肝細(xì)胞還可以用于評(píng)定多種目的化合物或組合物例如化學(xué)、藥學(xué)、 化妝、殺生物或生物學(xué)化合物，食品添加劑或組合物，或其它生物學(xué)活性劑的毒性。在這樣 的毒性測(cè)定中可優(yōu)選使用誘導(dǎo)肝細(xì)胞，因?yàn)檎T導(dǎo)肝細(xì)胞更接近生物體肝臟中存在的細(xì)胞類