濃縮抗體的方法及其治療性產(chǎn)品的制作方法
【專利說明】濃縮抗體的方法及其治療性產(chǎn)品
[0001] 本申請是申請日為2005年9月8日、中國申請?zhí)枮?00580038351.0、發(fā)明名稱為 "濃縮抗體的方法及其治療性產(chǎn)品"的發(fā)明申請的分案申請。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 分離、純化和濃縮生物材料的方法是已知的，包括例如色譜、超濾和冷凍干燥，一 般性地參考，R. Hatti-Kaul 等，"Downstream Processing in Biotechnology，"于《Basic Biotechnology》，第9 章，187-211 頁，第二版，Cambridge University Press (2001)。制 備用于人體施用的濃縮單克隆抗體制劑的方法是已知的，參見例如美國專利6, 252, 055,其 利用超濾，并使所得的濾出液回流。
[0004] 已有的抗體濃縮方法存在著一些問題，包括例如，通量低，過程時間長，膜面積大， 機(jī)械回收產(chǎn)率和損失，密集的操作者介入或操作，傳質(zhì)速率低，能量效率低，以及濃縮設(shè)備 的水壓限制等。上述問題及其它問題可促使制造總成本增高，并最終增加治療藥消費(fèi)者的 花費(fèi)。
[0005] 需要改良的方法來制備高度濃縮的蛋白質(zhì)制劑，例如液體抗體制品以及其治療產(chǎn) 品。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 在一般意義上，本發(fā)明一般地涉及濃縮蛋白質(zhì)的方法，例如濃縮抗體制品的方法， 含有該制品的藥物制劑，及它們在人類治療或動物治療中的用途。
[0008] 本發(fā)明在實(shí)施方案中提供制備高度濃縮的蛋白質(zhì)，例如抗體制品的方法；以及通 過該方法制備的治療產(chǎn)品，例如治療性抗體產(chǎn)品。由此，本發(fā)明提供一種濃縮蛋白質(zhì)的方 法，包括：對第一抗體制品進(jìn)行第一超濾，以提供第二抗體制品；對第二抗體制品進(jìn)行滲 濾，以提供經(jīng)滲濾的中間抗體制品；對經(jīng)滲濾的中間抗體制品進(jìn)行第二超濾，以提供第三抗 體制品，其中所述第一超濾，第二超濾和滲濾中的一項(xiàng)或多項(xiàng)是在升高的溫度，例如約30°C 到約50 °C進(jìn)行的。
[0009] 本發(fā)明在實(shí)施方案中還提供一種濃縮蛋白質(zhì)的方法，包括：對第一蛋白質(zhì)混合物 進(jìn)行第一超濾，以提供第二蛋白質(zhì)混合物；對第二蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行滲濾，以提供經(jīng)滲濾的 蛋白質(zhì)混合物；及對經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行第二超濾，以提供第三蛋白質(zhì)混合物，其中 所述第一超濾，第二超濾和滲濾中的一項(xiàng)或多項(xiàng)是在例如約45°C進(jìn)行。
[0010] 本發(fā)明還在實(shí)施方案中提供通過上述方法制備的高度濃縮的抗體組合物。
[0011] 本發(fā)明涉及下述各項(xiàng)。
[0012] 1.制備高度濃縮的抗體組合物的方法，包括：
[0013] 對第一抗體制品進(jìn)行第一超濾，以提供第二抗體制品；
[0014] 對第二抗體制品進(jìn)行滲濾，以提供經(jīng)滲濾的中間抗體制品；及
[0015] 對經(jīng)滲濾的中間抗體制品進(jìn)行第二滲濾，以提供第三抗體制品；
[0016] 其中所述第一超濾，第二超濾和滲濾中的一項(xiàng)或多項(xiàng)在約30°C到約50°C條件下 完成。
[0017] 2.項(xiàng)1的方法，其中所述第一超濾，第二超濾和滲濾中的一項(xiàng)或多項(xiàng)在約35°C到 約50°C條件下完成。
[0018] 3.項(xiàng)1的方法，其中所述第一超濾，第二超濾和滲濾中的一項(xiàng)或多項(xiàng)在約45°C條 件下完成。
[0019] 4.項(xiàng)1的方法，其中所述第一超濾，第二超濾和滲濾中的一項(xiàng)或多項(xiàng)在45°C ±5°C 條件下完成。
[0020] 5.項(xiàng)1的方法，其中所述第一抗體制品的抗體濃度為約0. 1到約10克每升。
[0021] 6.項(xiàng)1的方法，其中所述第一抗體制品的抗體濃度為約1到約5克每升。
[0022] 7.項(xiàng)1的方法，其中所述第二抗體制品的抗體濃度為約10到約50克每升。
[0023] 8.項(xiàng)1的方法，其中所述第二抗體制品的抗體濃度為約20到約40克每升。
[0024] 9.項(xiàng)1的方法，其中所述第三抗體制品的抗體濃度為約50到約250克每升。
[0025] 10.項(xiàng)1的方法，其中所述第三抗體制品的抗體濃度為約100到約230克每升。
[0026] 11.項(xiàng)1的方法，其中所述第三抗體制品的抗體濃度為約170到約200克每升。
[0027] 12.項(xiàng)1的方法，其中所述經(jīng)滲濾的中間抗體制品和第三抗體制品包含超濾截留 液。
[0028] 13.項(xiàng)1的方法，其中所述中間抗體制品的抗體濃度為約25到約35克每升，且所 述第三抗體制品的抗體濃度為約170到約200克每升。
[0029] 14.項(xiàng)1的方法，其中所述抗體制品包含抗-IgE抗體。
[0030] 15.項(xiàng)1的方法，其中所述方法經(jīng)過約1到10小時完成。
[0031] 16.項(xiàng)1的方法，其中所述方法經(jīng)過約2到5小時完成。
[0032] 17.項(xiàng)1的方法，其中所述方法經(jīng)過約3小時完成。
[0033] 18.項(xiàng)1的方法，其中所述第一和第二超濾使用標(biāo)稱孔徑為約5到約50千道爾頓 的超濾I旲完成。
[0034] 19.項(xiàng)1的方法，其中所述第一和第二超濾使用標(biāo)稱孔徑為約10到約30千道爾頓 的超濾I旲完成。
[0035] 20.項(xiàng)1的方法，其中所述第一抗體制品含有表觀分子量為約100到約200千道爾 頓的抗體。
[0036] 21.項(xiàng)1的方法，其中所述第一抗體制品含有表觀分子量為約150千道爾頓的抗 體。
[0037] 22.項(xiàng)1的方法，其中所述第一超濾濃縮第一抗體制品以提供抗體濃度為約30克 每升的第二抗體制品，所述第二超濾濃縮中間抗體制品以提供抗體濃度為約170克到約 200克每升的第三抗體制品。
[0038] 23.項(xiàng)1的方法，其中所述第一超濾和第二超濾使用相同的超濾膜完成。
[0039] 24.項(xiàng)1的方法，其中所述第一超濾和第二超濾使用再生纖維素復(fù)合材料超濾膜 完成。
[0040] 25.項(xiàng)1的方法，其中所述滲濾在恒定體積，恒定濃度，或恒定體積且恒定濃度條 件下實(shí)現(xiàn)緩沖液交換。
[0041] 26.項(xiàng)1的方法，其中所述滲濾實(shí)現(xiàn)約5到約15倍體積的緩沖液交換。
[0042] 27.項(xiàng)1的方法，其中所述滲濾實(shí)現(xiàn)約8倍體積的緩沖液交換。
[0043] 28.項(xiàng)1的方法，其中所述滲濾將第一緩沖液交換為第二緩沖液。
[0044] 29.項(xiàng)28的方法，其中所述第一緩沖液包含氯化鈉水溶液和TRIS緩沖液的混合 物，第二緩沖液包含含水組氨酸氯化物和精氨酸氯化物的混合物。
[0045] 30.項(xiàng)1的方法，其中所述第一超濾、第二超濾和滲濾利用橫跨超濾膜的切向流過 濾來完成。
[0046] 31.項(xiàng)1的方法，其中所述第一超濾、第二超濾和滲濾利用橫跨相同超濾膜的切向 流過濾來完成。
[0047] 32.項(xiàng)1的方法，其中所述第三抗體制品的產(chǎn)率高于約70重量％，是基于第一抗體 制品中抗體的重量。
[0048] 33.項(xiàng)32的方法，其中所述第三抗體制品的產(chǎn)率為約80到約100重量％，是基于 第一抗體制品中抗體的重量。
[0049] 34.項(xiàng)1的方法，其中第一超濾具有約0. 5L/min/ft2到約5L/min/ft2的回流速率。
[0050] 35.項(xiàng)1的方法，其中所述超濾和滲濾在約10到約50p. s. i.的跨膜壓力條件下完 成。
[0051] 36.項(xiàng)1的方法，其中提供可檢測的生物負(fù)荷小于約100CFU/mL的抗體濃縮物。
[0052] 37.濃縮蛋白質(zhì)的方法，包括：
[0053] 對第一蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行第一超濾，以提供第二蛋白質(zhì)混合物；
[0054] 對第二蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行滲濾，以提供經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)混合物；及
[0055] 對經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行第二滲濾，以提供第三蛋白質(zhì)混合物；其中所述第 一超濾，第二超濾和滲濾中的一項(xiàng)或多項(xiàng)在約30°C到約50°C條件下完成。
【附圖說明】
[0056] 圖1顯示本發(fā)明的實(shí)施方案中用于實(shí)現(xiàn)制備方法的裝置。
[0057] 圖2到圖17顯示本發(fā)明的實(shí)施方案中過程的不同階段或模式中觀察或測量到的 不同過程值。
[0058] 圖18和19顯示本發(fā)明的實(shí)施方案中升高的溫度對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。
[0059] 圖20和21顯示本發(fā)明的實(shí)施方案中升高的溫度對生物負(fù)荷控制的影響。
[0060] 圖22顯示本發(fā)明的實(shí)施方案中升高的溫度對過程流量和過程時間的影響。
[0061] 圖23到25顯示本發(fā)明的實(shí)施方案中經(jīng)放大的過程的不同階段或模式中觀察或測 量到的不同過程值。
[0062] 發(fā)明詳述
[0063] 下面將援引附圖（如果有的話）對本發(fā)明的不同實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)的描述。援 引不同的實(shí)施方案并不限制本發(fā)明的范圍；本發(fā)明的范圍僅受本文所附的權(quán)利要求書的限 制。另外，本說明書中列出的任何示例都非意在限制，而僅僅是提出被要求保護(hù)的發(fā)明的多 種可能的實(shí)施方案中的一些。
[0064] 除非另有說明，使用下述表述：
[0065] "超濾"（"ultrafiltering"，"ultrafiltration"，"ultrafiltered"，"UF" 及 類似術(shù)語）涉及，例如，使用具有合適的物理和化學(xué)性質(zhì)的合成半透膜（semi-permeable membrane)，主要基于分子大小和形狀來區(qū)分混合物中的分子，實(shí)現(xiàn)不同分子的分離或相似 分子的濃縮。
[0066] "滲濾"（''diafiltering''，''diafiltration''，''diafiltered''，''diafiltrating''，'， DF"及類似術(shù)語）涉及，例如，使用超濾膜從含有蛋白質(zhì)、肽、核酸或其它生物分子的溶液或 混合物中去除或置換鹽或溶劑，或降低鹽或溶劑的濃度。
[0067] "跨膜壓力"（transmembrane pressure)或"TMP"是指從膜的進(jìn)液側(cè)向?yàn)V液側(cè) 所施加的平均壓力，以TMP[bar] = [(PF+PK)/2]-Pf計算，其中Pf是進(jìn)液壓力，？ 1；是截留液 (retentate)壓力，Pf是濾液壓力。
[0068] "切向流過濾"（tangential flow filtration)，"錯流過濾"（cross flow filtration)，"TFF"及類似術(shù)語是指含有溶質(zhì)的溶液以切向流過UF膜，并通過施加壓力使 低分子量的鹽或溶質(zhì)穿過的過濾模式。
[0069] "抗體"在本文中使用其最廣的含義，具體覆蓋完整（infant)單克隆抗體、多克隆 抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體（如雙特異性抗體）、及抗體片段，只要它 們展示所需生物學(xué)活性?？贵w是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的能夠識別和結(jié)合特異性抗原的蛋白質(zhì)。從 結(jié)構(gòu)上說，抗體是一種Y形的蛋白質(zhì)，由4條氨基酸鏈，即2條輕鏈和2條重鏈組成。在一 種對于本申請而言足夠的簡化模型中，每個抗體主要有兩個區(qū)域：一可變區(qū)和一恒定區(qū)。可 變區(qū)位于Y形的臂的末端，與目標(biāo)抗原結(jié)合并相互作用?？勺儏^(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)， 其識別并結(jié)合抗原上的特定結(jié)合位點(diǎn)。恒定區(qū)位于Y形的尾部，被免疫系統(tǒng)識別并與之相 互作用（Janeway，C，Travers，P.，Walport，M· ,Shlomchik(2001)《Immuno Biology》，第 5 版，Garland Publishing, New York)。目標(biāo)抗原通常具有多個結(jié)合位點(diǎn)，又稱表位，它們被 多種抗體上的CDR所識別。特異性結(jié)合不同表位的各種抗體具有不同的結(jié)構(gòu)。因此，一種 抗原可以具有多于一種相應(yīng)的抗體。
[0070] 基本的4鏈抗體單位是由兩條相同的輕（L)鏈和兩條相同的重（H)鏈組成的異四 聚體糖蛋白（IgM抗體由5個所述異四聚體基本單位和另一稱為J鏈的多肽組成，因此含有 10個抗原結(jié)合位點(diǎn)，而分泌型IgA抗體可聚合形成包括2到5個基本4鏈單位及J鏈的多 價的集聚體（assemblage))。對于IgG，4鏈單位通常為約150, 000道爾頓。每條L鏈通過 一個共價二硫鍵連接于一條H鏈，而兩條H鏈根據(jù)其同種型通過一個或多個二硫鍵互相連 接。每條H和L鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在N端具有可變區(qū)（Vh)，其后 在α和γ鏈同種型的情況下有3個恒定區(qū)（CH)，在μ和ε同種型的情況下有4fCH區(qū)。 每條L鏈在N末端具有可變區(qū)（')隨后在其另一端是恒定區(qū)（Q)。八與Vh排列在一起，Cl與重鏈的第一個恒定區(qū)（ChI)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在重鏈和輕鏈的可變區(qū) 之間形成界面。一條Vh和一條VJS對共同形成一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。不同類型的抗體的結(jié) 構(gòu)和性質(zhì)可參見，例如，《Basic and Clinical Immunology》，第 8版，D.Stites，A. Terr 和 T. Parslow 編，Appleton&Lange, Norwalk, CT, 1994，第 71 頁和第 6 章。
[0071] 來自任何脊椎動物物種的L鏈，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可歸入兩種截然不 同的稱作卡帕（K)和拉姆達(dá)（λ)的類型中的一種。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)（Ch)的氨基酸序 列，可將免疫球蛋白歸入不同的類別或同種型。免疫球蛋白有五種主要的類別：IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM，其具有的重鏈分別稱作α、δ、ε、γ和μ。γ和α類根據(jù)CJi列和功 能的相對次要的差異進(jìn)一步分為亞類，例如，人表達(dá)下面的亞類：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl 和 IgA2〇
[0072] 術(shù)語"可變的"是指不同抗體的可變區(qū)特定部分的序列差異很大。V區(qū)介導(dǎo)抗原結(jié) 合并決定具體抗體對其具體抗原的特異性。然而，在約Iio個氨基酸的整個可變區(qū)中可變 性的分布并不均等。相反，V區(qū)組成如下：多個具有15-30個氨基酸的相對恒定序列段（稱 為框架區(qū)，F(xiàn)R)，以及位于它們之間的變異性極高的較短區(qū)域（稱為高變區(qū)，每一個高變區(qū) 具有9-12個氨基酸）。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別包含四個FR，它們大多采用β折疊 構(gòu)象，通過三個高變區(qū)相連，這些高變區(qū)與β折疊結(jié)構(gòu)形成環(huán)狀，有時形成部分環(huán)狀。每條 鏈的高變區(qū)通過FR連接至十分接近，并與其他鏈的高變區(qū)共同形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn) (參見 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，（1991))。恒定區(qū)不直 接參與抗體對抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)功能，如使抗體參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒作用（ADCC)。
[0073] 術(shù)語"高變區(qū)"在用于本文時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通 常包含來自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"⑶R"的氨基酸殘基[如約\的Kabat殘基24-34 (LI)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)左右，及約 Kabat 殘基 31-35B (HI)、50-65 (H2)和 95-102 (H3) 左右；（見Kabat等，同上）]和/或來自"高變環(huán)"的殘基[例如約八中的Chothia殘基 26-32 (LI)、50-52(L2)和 91-96 (L3)左右，及 Vh中的 Chothia 殘基 26-32 (HI)、52A-55(H2) 和 96-101 (H3)左右；Chothia 和 Lesk, J. Moh BioL 19