PCT/US02/33050。適 用于本發(fā)明的其它抗體包括抗-CD20抗體和類似的抗體包括人源，非人源，鼠源，雜合，和 嵌合形式。見例如美國專利6, 582, 959 (VEGF)和美國專利申請2002/012297A1 (人VEGF)。
[0103] 在實施方案中，本發(fā)明的范圍中包含的抗體包括雜合和重組抗體（例如，"人源化" 和"人源"抗體），無論其來源的物種、免疫球蛋白類型或亞類的指定，以及抗體片段（例如， Fab，F(xiàn)(ab'）2及 Fv)。見美國專利 4, 816, 567 ;Mage 和 Lamoyi，于《Monoclonal Anitibody Production Techniques and Applications》中，79-97,Marcel Dekker, Inc. New York， (1987)〇
[0104] 還可以使用單克隆抗體，單克隆抗體可以例如用例如Clackson等（1991) Nature, 352:624-628 及 Marks 等，（1991) J. Mol. Biol. 222:581-597 中所述的技術(shù)從噬菌體 抗體文庫中分離。單克隆抗體包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自某 特定的物種或?qū)儆谀程囟ǖ目贵w類型或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余 部分與衍生自另一特定的物種或?qū)儆诹硪惶囟ǖ目贵w類型或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相 同或同源，以及這樣的抗體的片段，只要它們展示所需的生物活性（美國專利4, 816, 567， 和 Morrison 等·（1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855)。嵌合抗體可包含"靈 長類化"（primatized)抗體，其包含衍生自非人靈長類動物的可變區(qū)抗原結(jié)合序列（例如 舊大陸猴類，猿等）和人源恒定區(qū)序列。
[0105] 單克隆抗體是高度特異性的，其針對單個抗原性位點。另外，與包含針對不同決 定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制品相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定 簇。單克隆抗體制品中的每一單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性以 外，單克隆抗體制品具有這樣的優(yōu)點，即它們可以合成，且沒有其它免疫球蛋白的污染。因 此，修飾語"單克隆"表明由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，即構(gòu)成該群體的單個 抗體是相同的，除了可能天然發(fā)生的，并可能以次要的量存在的突變以外，并不解釋為需要 通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，本發(fā)明中使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler和 Milstein，Nature 256:495(1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來 制備（參見例如美國專利4, 816, 567)。其它已知的抗體生產(chǎn)方法記載于，例如，Goding, 《Monoclonal Antibodies:Principles and Practice》，59-103,Academic Press(1986)； Kozbor，J. Immunol, 133:3001(1984) .Brodeur 等，《Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications》，51-63,Marcel Dekker, Inc.，New York(1987) 〇
[0106] 已經(jīng)使用了多種方法來制備單克隆抗體（Mabs)。雜交瘤技術(shù)涉及產(chǎn)生單一類型 抗體的克隆細胞系，使用不同物種的細胞，包括小鼠（鼠源），倉鼠，大鼠和人。另一種制備 Mab的方法使用基因工程技術(shù)，包括重組DNA技術(shù)。用這些技術(shù)所制備的單克隆抗體包括例 如嵌合抗體和人源化抗體等。嵌合抗體將來自多于一個物種的DNA編碼區(qū)域組合起來。例 如，嵌合抗體的可變區(qū)可來自于小鼠，恒定區(qū)可來自于人。人源化抗體主要地來源于人，雖 然其含有非人源部分。象嵌合抗體一樣，人源化抗體可含有完全人源的恒定區(qū)。但和嵌合 抗體不同的是，可變區(qū)可部分地來源于人。人源化抗體的非人的，合成的部分往往來源于鼠 源抗體的CDR。在任何情況下，這些區(qū)域?qū)τ谑箍贵w得以識別和結(jié)合特定抗原都具有關(guān)鍵意 義。
[0107] 如提到過的，鼠源抗體在抗體技術(shù)中起重要作用。雖然鼠源抗體對診斷和短期療 法是有用的，它們不能長期施用于人而同時不增加有害的免疫反應(yīng)。該反應(yīng)稱為人抗小鼠 抗體（HAM)，當(dāng)人免疫系統(tǒng)識別鼠源抗體為外來的并對其攻擊時發(fā)生。HAM反應(yīng)可導(dǎo)致中 毒性休克或乃至死亡。嵌合抗體和人源化抗體使施用的抗體的非人源部分最小化，從而減 少HAMA反應(yīng)的可能。另外，嵌合抗體和人源化抗體還有活化人再次免疫反應(yīng)，例如抗體依 賴的細胞毒作用的益處。
[0108] "完整的"抗體包含結(jié)合抗原的可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)（CL)和重鏈恒定區(qū)CH1， CH2和CH3。這些恒定區(qū)可以是天然序列的恒定區(qū)（例如，人源天然序列恒定區(qū)）或其氨基 酸序列變體。完整的抗體可以有一種或多種"效應(yīng)物功能"，其指可歸結(jié)為抗體Fc區(qū)（天然 序列的Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū)）的生物活性。抗體效應(yīng)物功能的例子包括Clq結(jié)合； 補體依賴的細胞毒作用；Fc受體結(jié)合；抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（ADCC);吞噬作用； 細胞表面受體（例如B細胞受體；BCR)的下調(diào)等。
[0109] 取決于完整抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可以將完整抗體歸于不同的"類型"。 完整的抗體主要有五個類型：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中某些類型還可以分為"亞 類"（同種型），例如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgA和IgA2。與所述不同類型的抗體對應(yīng)的 重鏈恒定區(qū)分別稱為α，β，ε，γ和μ。不同類型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型 是眾所周知的。
[0110] 在實施方案中，第一超濾濃縮第一抗體制品以提供抗體濃度為約30克每升的第 二抗體制品，第二超濾濃縮中間抗體制品（由滲濾而得）以提供抗體濃度為例如約170到 約200克每升的第三抗體制品。第一超濾和第二超濾可以用相同的超濾膜完成，并且如果 需要可在同一容器或過程回路中完成，例如，來最大地減少操作、損失、泄漏等等對產(chǎn)率、效 率和經(jīng)濟性的影響。第一超濾和第二超濾可以用任何合適的超濾設(shè)備或超濾膜完成。能夠 進行切向流過濾（TFF)操作完成超濾和滲濾的合適的超濾設(shè)備及超濾膜有很多是可以商 購的，例如來自Millipore，Pall Corp.，Sartorius等供應(yīng)商。在實施方案中，合適的超濾 膜可以是，例如，任何再生纖維素復(fù)合材料（regenerated cellulose composite)，與其它 可獲得的超濾膜，例如聚醚砜相比，該材料的蛋白質(zhì)吸附曲線相對較低。
[0111] 滲濾操作將第一和第二抗體制品中的第一緩沖液組合物交換為第三抗體制品中 所需的第二緩沖液。在實施方案中，第一緩沖液可包含，例如，氯化鈉水溶液和TRIS緩沖液 的混合物，第二緩沖液可包含，例如，組氨酸氯化物和精氨酸氯化物水溶液的混合物。滲濾 可以在恒定體積，恒定濃度，或恒定體積及恒定濃度條件下完成緩沖液交換。在實施方案 中，滲濾在恒定體積及恒定濃度條件下完成緩沖液交換。滲濾可以完成例如約5倍到約15 倍體積（即滲濾體積）的緩沖液交換。滲濾還可完成例如約8倍體積（即滲濾體積）的緩 沖液交換，即，含有要交換的抗體制品的樣品體積的8倍。例如，10升的抗體制品可以用5 倍（滲濾體積），或50升體積的交換緩沖液滲濾。交換體積和優(yōu)選的交換體積考慮多個因 素的平衡，例如過程通量效率，產(chǎn)品純度，政府和消費者-患者可接受性的標準，以及類似 的標準，并可依賴于，例如第一抗體制品中緩沖液（例如第一緩沖液）的濃度和類型，以及 類似的考慮因素。
[0112] 第一超濾、第二超濾和滲濾優(yōu)選地由通過超濾膜的切向流過濾（TFF模式）完成， 且優(yōu)選各個步驟的滲濾膜是相同的膜。最后總物料（即第三抗體制品）中產(chǎn)品的收率可以 是例如高于70重量％，例如約80到約100重量％，基于第一抗體制品中的抗體的重量。第 三抗體制品的產(chǎn)率可以是，在實施方案中，高于約90重量％，在實施方案中，高于約95重 量％，在實施方案中，乃至高于約98重量％，基于第一抗體制品中的抗體的重量。
[0113] 第一超濾的回流速率（recirculation rate)可以為，例如，約50到1，OOOmL/ min，優(yōu)選約100到1，000mL/min?？梢愿鶕?jù)可用的膜面積對回流速率進行調(diào)節(jié)，例如， 5, 20, 200, 1，1，000平方英尺的膜面積，及類似的膜面積，所允許的回流速率依次增高。因 此，合適的經(jīng)調(diào)節(jié)的回流速率在實施方案中可以是例如約0. 5L/min/ft2到約5L/min/ft2。 超濾和滲濾可以在例如約5到約50p. s. i的跨膜壓力條件下完成。超濾和滲濾可以在例如 約10到約50p. s. i的跨膜壓力條件下完成。在本發(fā)明的實施方案中，提供了一種制備較稀 的抗體配方的抗體濃縮物的方法，該抗體濃縮物具有最小的生物負荷，例如，小于或低于檢 測限，例如，少于約100CFU/mL。
[0114] 本發(fā)明的抗體組合物可以是，例如，用于人體施用的濃縮單克隆抗體制品，例如以 大約或等于約100g/L(mg/mL)，例如約120到約170g/L。
[0115] 本發(fā)明的抗體組合物可以是例如免疫球蛋白，例如來自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM 類群的免疫球蛋白；其亞類；其重組體；其片段；以及前述的任何混合物。本發(fā)明的優(yōu)選的 抗體組合物包含重組的人源化抗-IgE抗體。本發(fā)明的抗體組合物可包含緩沖液。優(yōu)選的 緩沖液可以為，例如，組氨酸氯化物和精氨酸氯化物的水溶液的混合物。
[0116] 本發(fā)明的制備方法優(yōu)選地在相同設(shè)備中完成，沒有或只有最少的操作人員的介 入，例如圖1所示。
[0117] 第一抗體制品的提供或制備可使用多種化學(xué)、物理、機械或非機械，或生物化學(xué) 方法，例如，研磨（grinding)，超聲處理，勾衆(zhòng)（homogenization)，酶消化，溶劑萃取，離 心，色譜，以及類似方法及其組合，見，例如，上面提到的R. Hatti-Kaul等，"Downstream Processing in Biotechnology,"于《Basic Biotechnology》，第 9 章中。第三抗體制品 在需要時，可以使用例如納濾（以除去例如二價離子）、反滲透（以除去例如單價離子） 及類似的液體純化方法來進一步加工。本發(fā)明的第三抗體制品可以被包裝、儲存或直接 使用。在需要時，還可以使用例如更多的濃縮步驟，例如干燥、冷凍干燥、冷凍干燥-重溶 (reconstitution)，及類似方法來進一步加工。所得的經(jīng)過濃縮的第三抗體產(chǎn)品可以在一 段時間后用合適的液體重溶。
[0118] 參見附圖，圖1顯示本發(fā)明的實施方案中用于實現(xiàn)制備方法的一種設(shè)備，該設(shè)備 包括：超濾-滲濾系統(tǒng)（100)，其具有TFF超濾-滲濾（UF-DF)單元（110)，該單元具有UF-DF 膜（115)，并與回流槽（120)連通，該槽充當(dāng)進料液和截留液的主要儲存容器。在實施方案 中，槽（120)可具有溫度控制系統(tǒng)，其包含，例如，絕熱夾套（125)，恒溫或控溫的加熱元件 (126)，例如變阻加熱器（rheostat resistive heater)或循環(huán)加熱液體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括 加熱器（未顯示），流量調(diào)節(jié)器（127)，例如回流泵，以及合適的熱傳遞流體，例如水或二醇 (glycols)或其混合物。所有循環(huán)中的組件或?qū)ρh(huán)流動或加工起貢獻的組件，例如管道、 閥門，泵、槽和類似的組件，可任選為絕熱的，或者可以適于外部加熱，以嚴密地控制所要求 的溫度，并避免回流的液體回路中過濾室（110)和回流槽（120)之內(nèi)和之間的溫度偏差。在 實施方案中，例如，當(dāng)系統(tǒng)在例如補料分批模式下進行第一超濾時，系統(tǒng)可包含任選的進料 槽（128)，其與回流進料槽（120)流動連通，可以用來，例如，從回流槽（120)對耗盡的液相 進行補充。
[0119] 泵（130)抽動進料液從槽（120)通過UF/DF單元（110)，然后將所得的截留液（進 料液的未被過濾的或被膜排阻的部分）回流到回流槽（120)。第二個槽（140)在恒定體積 滲濾過程中容納緩沖液并任選地用泵（未顯示）將其抽到主循環(huán)（110 - 120回路）中。例 如，導(dǎo)入主循環(huán)的緩沖液的添加速率和體積優(yōu)選地與濾液通過膜（115)離開主循環(huán)的速率 和體積相同。緩沖液槽（140)可任選地用夾套（143)絕熱，并可包含等價于上述的加熱元 件的裝置和回流泵（未顯示）?？梢允褂萌芜x的惰性氣體源（145)，例如氮氣源，或其它壓 縮空氣源，用于例如回收產(chǎn)品，壓回截留液，排除氧氣，沖洗（flushing)、清洗，檢查膜完整 性及類似操作。第三個槽（160)用來收集和回收從單元（110)流出的濾液。閥（150,170) 可以視情況合適地使用來調(diào)控系統(tǒng)中的方向和任選地調(diào)控液體流速。所有的閥和泵都可以 手動操作，通過協(xié)調(diào)的計算機控制操作，或通過上述兩種方式操作。任選的第四個槽（190) 和流出流（exit stream)例如當(dāng)配有可選的監(jiān)控裝置（180)例如光密度儀、任選的濾器例 如保護濾器（guard filter)和產(chǎn)品濾器、或其它類似的子系統(tǒng)時，可提供輔助的廢料沖洗、 產(chǎn)品回收、或監(jiān)控系統(tǒng)。在實施方案中，主流體循環(huán)（110 - 120回路）可任選地配有在線 (in-line)監(jiān)測系統(tǒng)。
[0120] 本發(fā)明的方法所制備的濃縮抗體制品可用于人體治療性施用，包括免疫球蛋白產(chǎn) 品，用于肌肉內(nèi)（IMIG)或靜脈內(nèi)（IVIG)施用。本發(fā)明的濃縮抗體制品可包含穩(wěn)定劑，例 如，緩沖的氨基酸鹽溶液，單糖，或類似的穩(wěn)定劑，合適的離子螯合劑，例如EDTA或檸檬酸 根離子，及其組合，參見例如，Wang, Y.-C. J.等，"Parenteral formulations of proteins and peptides: stability and stabilizers,〃J.Parenteral Sd. Technol,42, Suppl. S3-S26 (1988)。Derwent 提供的 JP01268646A(AN89-359879)的摘要稱，該申請描述了一種 工8〇3單克隆抗體的注射制品，其濃度為0. 1微克/mL到100mg/mL。這些出版物中公開的主 題被認為在本發(fā)明的范圍之外。
[0121] 本發(fā)明的制品可基本上不含聚集物（aggregates)。聚集的污染物的可接受的水 平為少于，例如，約5重量％，理想地為少于2重量％?？梢詫崿F(xiàn)低達0. 2重量％的水平，雖 然1重量％的聚集的污染物是更通常的。優(yōu)選地，實施方案中的制劑也可以基本上不含有 用于穩(wěn)定多克隆制劑的常規(guī)賦形劑，例如甘氨酸和/或麥芽糖。
[0122] 本發(fā)明提供一種用于人體施用的單克隆抗體制品，其特征在于該制品中的抗體是 重組抗體，并且其濃度可為100mg/mL或更高，優(yōu)選高于150mg/mL。優(yōu)選地，該制劑基本上不 含任何蛋白質(zhì)聚集物。
[0123] 本發(fā)明的藥物制劑的pH將取決于具體的施用途徑。但是，為了使抗體在濃縮的溶 液中的溶解度最大化，該溶液的pH應(yīng)該不同于抗體的等電點（pi)的pH。
[0124] 在本發(fā)明的實施方案中，設(shè)想所述單克隆抗體制品可用于人體治療。可以治療多 種人體紊亂例如癌癥或感染性疾病，例如上面提到的那些，以及免疫紊亂例如T細胞介導(dǎo) 的紊亂，包括嚴重脈管炎（severe vasculitis)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，以及自 身免疫紊亂，例如多發(fā)性硬化，移植物抗宿主病，銀肩病，青少年型糖尿病（juvenile onset diabetes)，斯耶格倫氏病，甲狀腺疾病，重癥肌無力，移植排斥，以及類似的紊亂或病癥，以 及