] 表 5
[0192]
[0193] 過程結束后，用0.1 N NaOH，lL/ft2單通沖洗，然后0. 5L/ft2全回流30min來再生 膜。然后用HVft2PW沖洗。然后用300ppm Minncare?全回流30min。用IIVft2PW再次 沖洗系統(tǒng)，最后用〇. IN NaOH回流15min并儲存。回收的總物料稀釋到80g E25/L并調節(jié) 為20禮組氨酸/250禮蔗糖/0.02%聚山梨醇20/?!16.0的最終配方。對進料的0-總物料 和最終回收的總物料通過大小排阻色譜（SEC)分析產品質量。數(shù)據(jù)總結于表6。
[0194] 表 6
[0195]
[0196] 實施例3用初始進料-分批模式高濃度配制rhuMAb E26
[0197] 重復實施例1，并作下述的改變。濃縮/配制物是rhuMAb E26( -種針對IgE的 重組人單克隆抗體）。從本實施例得到的產品被用于毒理分析。組裝帶有11. 4平方英尺， 30, 000道爾頓的再生纖維素復合材料膜的Millipore Pelicon超濾/滲濾系統(tǒng)。流速設 定為5. 0L/min(0. 44L/min/ft2)的恒定流速。超濾和滲濾操作過程中截留液壓力保持在約 6 - 8psig之間。從在先進行的Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質總物料經測定為6. 7g E26/L，體積為 59. 3L。
[0198] 由于進料的總物料大于回流容器，以進料分批模式開始UFl過程。在該模式下，以 與濾液通過TFF膜排出時大致相同的速率將Q-總物料加入回流容器。當剩余的Q-總物料 被轉移到回流容器后，以分批模式繼續(xù)進行UFl過程。在UFl中總物料被濃縮到50g E26/ L (約7. 9L)。滲濾開始時回流容器的溫度設定點升高到40°C。溫度的升高和控制是通過使 加溫的乙二醇流過槽的外夾套實現(xiàn)的。然后用8個滲濾體積的滲濾緩沖液滲濾該總物料。 滲濾在恒定體積下進行，這是通過使輸送到回流槽中的緩沖溶液的流速與從系統(tǒng)移出的濾 液的流速一致而實現(xiàn)的。滲濾結束后，進一步在UF2模式下濃縮總物料到最終濃度為109g E26/L(3.6L)。還使用升高的溫度設定點40°C進行該階段。然后，進行低壓降混合，其中控 制進料泵以維持5 - IOpsig的跨進料通道壓降。表7總結了 UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2的 處理量和通量結果。
[0199] 表 7
[0200]
[0201]
[0202] 圖8顯示進料流速（210)，槽溫（220)，進料壓差（230)，TMP(240)和濾液流速 (250)的觀察或測量的經時過程值。
[0203] 圖9顯示E26濃度（910)，通量（920)和TMP (940)的觀察或測量的經時過程值。
[0204] 圖10顯示觀察或測量的UFl (1010)和UF2 (1020)壓力降對蛋白質濃度的經時過 程值。
[0205] 在即將回收產品之前，分析IOmL的樣品以檢測和滴定生物負荷。通常的拒絕限 (reject limit)為1,000集落形成單位（CFU)每mL。本測定的結果為1.8CFU/mL，該值在 這一步是合適的，并遠低于拒絕限。為了確定回收中損失的質量，將908. ImL DF緩沖液加 入系統(tǒng)，回流約5分鐘，并用上述同樣的工序回收。分析該回收的總物料和其它總物料的蛋 白濃度。結果總結于表8。
[0206] 表 8
[0207]
[0208] 回收的總物料稀釋到80g E25/L并調節(jié)為50mM組氨酸/150mM海藻糖/0. 02%聚 山梨醇20/pH 6. 0的最終配方。對進料的Q-總物料、UFl后的總截留液，DF后的總截留液， 以及最終回收的總物料通過大小排阻色譜（SEC)分析產品質量。數(shù)據(jù)總結于表9。
[0209] 表 9
[0210]
[0211]
[0212] 實施例4
[0213] 高濃度配制rhuMAb E26用于毒理分析-比較IOkD和30kD
[0214] 重復實施例3,并作如下改變。使用兩套預試級UF系統(tǒng)來濃縮/配制rhuMAb E26。 組裝兩套帶有11. 4平方英尺的再生纖維素復合材料膜的Millipore Pelicon超濾/滲濾 系統(tǒng)，一套孔徑為10, 〇〇〇道爾頓，另一套孔徑為30, 000道爾頓。截留液壓力保持為約6 - 9psig〇
[0215] IOkD i寸稈
[0216] 從在先進行的Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質總物料經測定為5. 85g E26/ L，體積為62. 4L。在UFl中，總物料被濃縮到50g E26/L (約7. 3L)。滲濾結束后，進一步在 UF2模式下濃縮總物料到最終濃度為107. 5g E26/L(3. 4L)。表10總結了 UF1，DF，及UF2的 處理量和通量結果。
[0217] 表 10
[0218]
[0219] 為了確定回收中損失的質量，將987mL DF緩沖液加入系統(tǒng)，回流約5分鐘，并用上 面描述的工序回收。分析回收的總物料和其它總物料的蛋白濃度。結果總結于表11。
[0220] 表 11
[0221]
[0222] 圖11顯示，在IOkD過程的不同階段或模式，包括UF1(10)，DF(20)，UF2(30)，和低 壓差（40)中觀察或測量的進料流速（210)，槽溫（220)，進料壓差（230)，TMP (240)和濾液 流速（250)等參數(shù)的經時過程值。
[0223] 圖12顯示在IOkD過程的不同階段或模式，包括UFl (10)，DF (20)，UF2 (30)，和低 壓差（40)中觀察或測量的E26濃度（1210)，通量（1220)和TMP (1240)的經時過程值。
[0224] 圖13顯示IOkD過程的觀察或測量的UFl (1310)和UF2 (1320)壓降對蛋白質濃度 的經時過程值。
[0225] 30kD i寸稈
[0226] 從在先進行的Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質總物料經測定為5. 85g E26/ L，體積為64. 5L。在UFl中，初始的總物料被濃縮到50g E26/L (約7. 5L)。滲濾結束后，進 一步在UF2模式下濃縮總物料到最終濃度為117. 5g E26/L(3. 2L)。表12總結了 UF1，DF， 及UF2的處理量和通量結果。
[0227] 表 12
[0228]
[0229] 為了確定回收中損失的質量，將918mL DF緩沖液加入系統(tǒng)，回流約5分鐘，并用上 面描述的工序回收?；厥盏目偽锪舷♂尩?0g E26/L并調節(jié)為50mM組氨酸/150mM海藻糖 /0. 02%聚山梨醇20/pH 6. 0的最終配方。結果總結于表13。
[0230] 表 13
[0231]
[0232] 圖14顯示，在30kD過程的不同階段或模式，包括UFl (10)，DF (20)，UF2 (30)，和低 壓差（40)中觀察或測量的進料流速（210)，槽溫（220)，進料壓差（230)，TMP (240)和濾液 流速（250)的經時過程值。
[0233] 圖15顯示在30kD過程的不同階段或模式，包括UFl (10)，DF (20)，UF2 (30)，和低 壓差（40)中觀察或測量的E26濃度（1510)，通量（1520)和TMP (1540)的經時過程值。
[0234] 圖16顯示30kD過程的觀察或測量的UFl (1610)和UF2 (1620)壓降對蛋白質濃度 的經時過程值。
[0235] 實施例5
[0236] 液體rhuMAb E25規(guī)模擴大
[0237] 重復實施例1，并作如下改變。
[0238] 使用制備級UF系統(tǒng)來濃縮/配制液體rhuMAb E25 ( -種針對IgE的重組人單克 隆抗體）。該產品可用于治療用途和生物等效性（bio-equivalency)測試。組裝帶有226 平方英尺、30, 000道爾頓孔徑的再生纖維素復合材料膜的Millipore Pelicon超濾/滲濾 系統(tǒng)。每套系統(tǒng)由膜固定器、Viking S3S旋轉葉片進料泵、1/2〃316L不銹鋼回流管道，以及 250-L回流容器組成。
[0239] 回流容器使用一個250升316L帶不銹鋼夾套的槽。利用充入該槽夾套中的溫 度受調節(jié)的乙二醇來控制該槽的溫度。分別通過充蒸汽的熱交換器（steam-fed heat exchanger)或供給冷乙二醇來升高或降低充入槽夾套的乙二醇的溫度。
[0240] 對于本次運行，進料流速設定為114L/min(0. 5L/min/ft2)的恒定速率。在另外的 槽中制備滲濾緩沖液（20mM組氨酸/200mM精氨酸氯化物/pH6. 0)。在過程之前將該緩沖液 的溫度置于45°C。這使得在整個過程中能夠精確地控制溫度。
[0241] 該過程之前，以單通一排出模式沖洗掉系統(tǒng)儲存溶液（0.1 N NaOH)，首先用lL/ft2的注射用水（WFI)，然后用lL/ft2的滲濾溶液來沖洗。沖洗后，使0. 5L/ft2的滲濾緩沖液 回流IOmin來平衡系統(tǒng)。檢查回流的溶液的pH來確認平衡。
[0242] 從在先進行的Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質總物料經測定為5. 2562g E25/L，體積為1，141L。蛋白質溶于25mM Tris緩沖液及約200mM NaCl的溶液中，pH調節(jié) 到6.2。即將開始運行前，將該總物料的溫度設定點設為45°C。將蛋白質總物料通過0.22 微米滅菌級濾器輸送到回流容器中達到槽中約200L的水平來開始運行。在該容器中通過 頂置葉輪攪拌總物料，溫度保持于（40 - 50°C )。由于進料的總物料大于回流容器，以進料 分批模式開始UFl過程。在該模式下，以與濾液通過TFF膜排出大致相同的速率將Q-總物 料加入回流容器。當剩余的Q-總物料被轉移到回流容器后，以分批模式繼續(xù)進行UFl過 程。在UFl中總物料被濃縮到30g E25/L (約200L)。然后用8個滲濾體積的滲濾緩沖液滲 濾該總物料。滲濾過程中溫度保持在40°C-50°C。滲濾在恒定體積下進行，這是通過使輸 送到回流槽中的緩沖溶液的流速與從系統(tǒng)移出的濾液的流速一致而實現(xiàn)的。滲濾結束后， 進一步在UF2模式下濃縮總物料到最終濃度設定點>170g E25/L(35L)。還使用升高的溫 度設定點45°C +/_5°C進行UF2模式階段。然后，進行低壓降混合，其中控制進料泵以維持 5 - IOpsig的跨進料通道壓降。表7總結了 UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2的處理量和通量結 果。在回收前取樣進行光譜掃描（spec scan)以確認濃度。該樣品的濃度為191g E25/L， 總物料體積為31. 9L。
[0243] 表14總結了 UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2階段的處理量和通量結果。
[0244] 表 14
[0245]
[0246] 即將回收產品之前，取30mL樣品用于檢測和滴定生物負荷。結果為〈0. 13CFU/mL。 通過一系列步驟回收蛋白質總物料。首先利用添加到截留液管線的5L DF緩沖液以單通模 式將產物從膜排出。使產物先后濾過7. 4ft2,0. 22微米滅菌級保護濾器和2ft2,0. 22微米 滅菌級終濾器，進入回收槽。然后用旋轉葉片進料泵將回收槽中的總物料從槽中抽出。然 后用5psig的氮氣吹干來從槽和進料管線排出殘余的蛋白質溶液。最后一個階段是吹干膜 單元，此時其主要含有初次產物排出帶來的DF緩沖液。該階段也是使用在截留液管線最高 點施加的5psig氮氣?；厥盏目偽锪舷扔肈F緩沖液稀釋到約153g E25/L。最后，將總物料 調節(jié)為20mM組氨酸/200mM精氨酸-HC1/0. 04%聚山梨醇20/pH6. 0的最終配方。分別分析 回收的總物料、稀釋的總物料和調節(jié)過的總物料（Q-總物料）的蛋白質濃度。結果總結于 表15〇
[0247] 表 15
[0248]
[0249] 圖17顯示在該階段的不同階段或模式，包括UFl (10)，DFl (20)，DF2 (25)， UF2 (30)，和低壓差（50)中的進料流速（210)，槽溫（220)，進料壓差（230)，TMP (240)和濾 液流速（250)等參數(shù)的經時過程值。
[0250] 實施例6
[0251] 液體 rhuMAb Ε25 制備
[0252] 重復實施例5,并進行下列改變。使用制備級UF系統(tǒng)來濃縮/配制液體rhuMAb E25 (E25, 一種針對IgE的重組人單克隆抗體）。組裝帶有226平方英尺、30, 000道爾頓孔 徑的再生纖維素復合材料膜的Millipore Pelicon超濾/滲濾系統(tǒng)。每套系統(tǒng)由膜固定 器、Viking S3S旋轉葉片進料泵、1/2" 316L不銹鋼回流管道，以及250-L回流容器組成。 回流容器使用一個250升316L帶不銹鋼夾套的槽。進料流速設定為114L/min(0. 5L/min/ ft2)的恒定速率。在所有的使用前和使用后操作中，截留液壓力控制設定為IOpsig的恒定 值。超濾和滲濾中，系統(tǒng)使用(；311控制模式來控制通過膜的通量。在另外的槽中制備滲濾 緩沖液（20mM組氨酸/200mM精氨酸氯化物/pH6. 0)。在過程之前將該緩沖液的溫度置于 45°C。這使得在整個過程中能夠精確地控制溫度。從在先進行的Q-Sepharose色譜步驟得 到的蛋白質總物料經測定為5. 5438g E25/L，體積為1，082L。蛋白質溶于25mM Tris緩沖 液及約200mM NaCl的溶液中，pH調節(jié)到6. 2。即將開始運行前，將該總物料的溫度設定點 設為45°C。將蛋白質總物料通過0. 22微米滅菌級濾器輸送到回流容器中達到槽中約200L 的水平來開始運行。在該容器中通過頂置葉輪攪拌總物料，溫度保持于環(huán)境（40 - 50°C )。 由于進料的總物料大于回流容器，以進料分批模式開始UFl過程。在該模式下，以與濾液通 過TFF膜排出大致相同的速率將Q-總物料加入回流容器。在該模式下，以與濾液通過TFF 膜排出大致相同的速率將Q-總物料加入回流容器。當剩余的Q-總物料被轉移到回流容器 后，以分批模式繼續(xù)進行UFl過程。在UFl中總物料被濃縮到30g E25/L(約200L)。然后 用8個滲濾體積的滲濾緩沖液滲濾該總物料。滲濾過程中溫度保持在40°C-50°C。滲濾在 恒定體積下進行，這是通過使輸送到回流槽中的緩沖溶液的流速與從系統(tǒng)移出的濾液的流 速一致而實現(xiàn)的。滲濾結束后，進一步在UF2模式下濃縮總物料到最終濃度設定點>170g E25/L(35L)。還使用升高的溫度設定點45°C+/_5°C進行該階段。然后，進行低壓降混合， 其中控制進料泵以維持5 - IOpsig的跨進料通道壓降。在回收前取樣進行光譜掃描以確 認濃度。經時過程參數(shù)圖與上述圖17觀察和總結的結果相似。
[0253] 表 14
[0254]
[0255] 即將回收產品之前，取30mL樣品用于檢測和滴定生物負荷。該測試的結果低于檢 測限（〈〇. 13CFU/mL)。
[0256] 通過一系列步驟回收蛋白質總物料。首先利用添加到截留液管線的5LDF緩沖液 以單通模式將產物從膜排出。使產物先后濾過7. 4ft2,0. 22微米滅菌級保護濾器和2ft2， 0. 22微米滅菌級終濾器，進入回收槽。然后用旋轉葉片進料泵將回收槽中的總