6:901-917 (1987))。
[0074] 本文中術(shù)語"單克隆抗體"指從實質(zhì)上均一的抗體群獲得的抗體，即構(gòu)成該群體 的抗體除了在生成所述單克隆抗體期間可能產(chǎn)生的通常為少量的變體以外都相同。這 樣的單克隆抗體通常包括含有結(jié)合靶標的多肽序列的抗體，其中獲得該結(jié)合靶標的多 肽序列的過程包括從多個多肽序列中選擇單個結(jié)合靶標的多肽序列。例如，所述選擇 過程可以是從多個克隆，例如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆庫中選擇獨特的 克隆。應(yīng)當理解，還可以進一步改變所選擇的靶標結(jié)合序列，例如，來增加對靶標的親 和力，使靶標結(jié)合序列人源化，促進其在細胞培養(yǎng)中的生成，降低其體內(nèi)免疫原性，產(chǎn)生 多特異性抗體等等，并且包含改變的靶標結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與 通常包含針對不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制品相反，單克隆抗體制品 中的每一單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體制 品具有這樣的優(yōu)點，即它們通常沒有被其它的免疫球蛋白污染。修飾語"單克隆"表明 由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，并不解釋為需要通過任何特定方法來生產(chǎn)抗 體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來制備，包括，例如雜交瘤方 法（例如，Kohler 等，Nature, 256:495(1975) ;Harlow 等，Antibodies:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版，1988) ;Hammerling 等，于 《Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas》中，563-681，（Elsevier, Ν·Υ·，1981))， 重組DNA方法（見例如美國專利4,816, 567)，噬菌體展示技術(shù)（見，例如，Clackson 等，Nature,352:624-628(1991) ;Marks 等，J.Mot Biol.，222:581-597(1991) ;Sidhu 等，J. Mol. Biol. 338 (2) : 299-310 (2004) ;Lee 等，J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34):12467-12472(2004);及 Lee 等，了· Immunol. Methods 284(1-2) :119-132(2004)),以及在具有部分或全部人免疫球蛋白基 因座或具有編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生產(chǎn)人抗體或人樣（human-like) 抗體的技術(shù)（見，例如，WO 1998/24893 ;W0 1996/34096 ;W0 1996/33735 ;W0 1991/10741 ;Jakobovits 等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，90:2551 (1993) ;Jakobovits 等，Nature, 362:255-258(1993) ;Bruggemann 等，Year in Immuno·，7:33(1993);美國專 利 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 591，669 (都授權(quán)給 GenPharm) ;5, 545, 807 ;W0 1997/17852 ; 美國專利 5, 545, 807 ;5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;及 5, 661，016 ;Marks 等，Bio/Technology, 10:779-783(1992) ;Lonberg 等，Nature. 368:856-859 (1994) ;Morris on，Nature, 368:812-813(1994) ;Fishwild等，Nature Biotechnology, 14:845-851(1996); Neuberger, Nature Biotechnology, M:826(1996)；及 Lonberg 和 Huszar, Intern. Rev. Tmmunol.，13:65-93(1995)。
[0075] "嵌合"抗體（免疫球蛋白）的重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆?特定抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種 或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要 它們顯示出所需的生物學活性（美國專利4, 816, 567 ;Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。本文中使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個亞類。
[0076] 非人源（例如鼠源）抗體的"人源化"形式是最低限度含有衍生自非人源免疫球 蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人源免疫球蛋白（受體抗體）中的 高變區(qū)殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種（供體抗體）諸如小鼠、大鼠、兔 或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人源免疫球蛋白的Fv框 架區(qū)（FR)殘基用相應(yīng)的非人源殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗 體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能例如結(jié)合親和力。通 常，人源化抗體將包含基本上不少于至少一個、通常兩個如下可變區(qū)，其中所有或基本上所 有的高變環(huán)對應(yīng)于非人源免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有的FR區(qū)是人源免疫 球蛋白序列的FR區(qū)，雖然FR區(qū)可能包括一個或更多改善結(jié)合親和力的氨基酸取代。FR 中這樣的氨基酸取代的數(shù)目在H鏈中通常不超過6個，在L鏈中不超過3個。任選的是， 人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)（Fe)，通常是人源免疫球蛋白的恒定 區(qū)。更多細節(jié)參見 Jones et al·，Nature 321:522-525(1986) ;Riechmann et al·，Nature 332:323-329(1988);及 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)〇
[0077] "抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。 抗體片段的實例包括Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab'）2,和Fv片段；雙抗體；線性化抗體（見美國專利 5, 641，870,實施例 2 ;Zapata 等，Protein Ens.，8 (10) : 1057-1062 (1995));單鏈抗體分子； 和由抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體。
[0078] 抗體經(jīng)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個相同的稱為"Fab"的抗原結(jié)合片段和一個殘余 "Fc"片段，F(xiàn)c的名稱反映了其易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab'）2片段，它 有兩個抗原結(jié)合位點并仍能與抗原交叉結(jié)合。
[0079] Fab片段由一條完整的L鏈，H鏈的可變區(qū)（VH)，和一條重鏈的第一個恒定區(qū)（ChI) 組成。每條Fab片段就抗原結(jié)合而言是單價的，即，它含有單個抗原結(jié)合位點。用胃蛋白酶 酶消化抗體產(chǎn)生一個大的F (ab'）2片段，其大致相當于具有二價抗原結(jié)合活性的由二硫鍵 連結(jié)的兩個Fab片段，并且仍能夠交聯(lián)抗原。Fab'片段與Fab片段不同在于ChI區(qū)羧基末 端多出少數(shù)殘基，包括一個和多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab' -SH在本文中指代恒 定區(qū)半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab'。最初產(chǎn)生的F(ab'）2抗體片段是成對的Fab'片 段，其間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯(lián)也是已知的。
[0080] Fc片段包含由二硫鍵連結(jié)在一起的兩條H鏈的羧基末端部分?？贵w的效應(yīng)物功能 是由Fc區(qū)中的序列決定的，該區(qū)域也是特定細胞類型中出現(xiàn)的Fc受體（FcR)所識別的部 分。
[0081] "Fv"是包含完整抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共 價結(jié)合的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。這兩個區(qū)域的折疊產(chǎn)生6個高 變環(huán)（H鏈和L鏈各產(chǎn)生3個），它們提供用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié) 合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)（或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有 識別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點。
[0082] "單鏈Fv"，亦可縮寫為"sFv"或"scFv"，是包含連接成為單條多肽鏈的VjP Vl抗體區(qū)域的抗體片段。優(yōu)選的是，該sFv多肽在VjP八區(qū)域之間還包含多肽接頭，使得 scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見PlUckthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag，New York，269-315,1994。
[0083] "約"，在修飾例如本發(fā)明的方法中所用的組合物中成分的量、活性成分（active) 的濃度、緩沖液體積（buffer volume)、滲濾體積（diavolume)、孔徑（pore size)、表觀分 子量（apparent molecular)、分子量截留值、過程溫度、過程時間、產(chǎn)率、流速、壓力、生物負 荷、以及類似的值及其范圍時，是指可以由于，例如，制備濃縮物或使用溶液時通常的測量 和操作步驟，在這些步驟中的無心之錯，制備所述組合物或執(zhí)行所述方法時所用的成分的 制造、來源或純度的不同，或其它考慮因素而造成的用數(shù)值表示的量的差異。術(shù)語"約"還 涵蓋由于具有特定初始濃度或混合組成（mixture)的組合物隨時間變化（aging)而差異的 量。術(shù)語"約"還涵蓋由于混合或加工具有特定的初始濃度或混合組成的組合物而差異的 量。不管是否被"約"所修飾，權(quán)利要求都包括所述量的等價量。
[0084] "基本上由……組成"涉及獲得濃縮的蛋白質(zhì)組合物或抗體組合物的過程，該過程 包括權(quán)利要求中所列的步驟和成分，加上對該組合物的基本性質(zhì)和新穎性質(zhì)無實質(zhì)性影響 的其它步驟或成分，例如重復的步驟或緩沖介質(zhì)。實質(zhì)性地影響本發(fā)明的組合物及方法的 基本性質(zhì)的成分帶來不希望的特性，包括，例如，生物負荷，例如污染物相關(guān)的毒性或應(yīng)激 性。
[0085] 本文中所用的不定冠詞"a"或"an"及其相應(yīng)的定冠詞"the"應(yīng)理解為表示至少 一，或者說一或更多，除非另有說明。
[0086] 本發(fā)明在實施方案中提供上述的方法及其濃縮的抗體產(chǎn)品。
[0087] 在本發(fā)明的實施方案中，制備方法及其產(chǎn)品可以用于制備高度濃縮的抗體制品和 類似的制品，例如從天然或合成來源純化和濃縮蛋白質(zhì)或類似物質(zhì)，所述產(chǎn)品可用于治療 病癥，例如哮喘，癌癥，銀肩病，抑制血管發(fā)生，以及類似的病癥。
[0088] 在上述的本發(fā)明的制備高度濃縮的抗體的方法的實施方案中，下述進一步例示了 如何制備和使用本發(fā)明的制備方法和產(chǎn)品。
[0089] 在本發(fā)明的實施方案中，提供了一種制備高度濃縮的抗體組合物的方法，例如根 據(jù)按所述順序完成下列步驟，包括：
[0090] 對第一抗體制品進行第一超濾，所述第一抗體制品的濃度為，例如，約0. 1到約10 克每升（g/U，以提供作為截留液的第二抗體制品，其具有更高的抗體濃度，例如約10到約 50克每升；
[0091] 對所得的第二抗體制品進行滲濾，以提供作為截留液的經(jīng)滲濾的中間抗體制品， 其與所得的第二抗體制品截留液具有約相同的濃度，即，通過滲濾實現(xiàn)恒定體積下的緩沖 液置換；及
[0092] 對所述經(jīng)滲濾的中間抗體制品進行第二超濾，以提供作為截留液的第三抗體制 品，其具有更高的抗體濃度，例如約150到約200克每升。
[0093] 本發(fā)明的制備方法還可包括可選的產(chǎn)品回收步驟，例如本文所公開和說明的。
[0094] 在本發(fā)明的上述方法的實施方案中，第一超濾、滲濾和第二超濾中的一項或多項 可以在例如約30°C到70°C完成。在實施方案中，這些步驟可以在例如約35°C到約50°C完 成。在實施方案中，這些步驟還可在例如約45°C，例如從約45°C ±5°C完成。取決于抗體制 品的種類，對于在約70°C以上完成的方法，制品可顯示劣化（deterioration)，例如變性、 聚集（agglomeration)，及類似現(xiàn)象的征象。對于在約30°C到約35°C的溫度以下完成的方 法而言，流速通常過低、過程時間過長，因此對于高效的大量生產(chǎn)來說，較低溫度下的方法 較缺乏吸引力。
[0095] 在實施方案中，第一抗體制品的抗體濃度可以為，例如，約0. 1到約100克每升（g/ L)。抗體濃度為，例如，典型地可從例如離心、過濾、色譜及類似程序等其他初步蛋白質(zhì)或抗 體純化步驟或方法獲得的通常濃度。可以從第一超濾獲得的第二抗體制品的抗體濃度可以 為例如約10到約50克每升，例如約20到約40克每升，如30克每升。中間抗體的抗體濃 度的范圍可以依賴于例如多個因素的平衡，所述因素例如用特定的含第二抗體制品的緩沖 液可實現(xiàn)的樣品體積和樣品流量。中間抗體制品的抗體濃度可以為例如約25到約35克每 升，第三抗體制品的抗體濃度可以為例如約170到約200克每升。第三抗體制品在實施方 案中可具有例如約50到約250克每升的抗體濃度，例如約100到約230克每升，約170到 約200克每升，例如185克每升。
[0096] 對于理解了本發(fā)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，中間抗體制品和第三抗 體制品包含相同的超濾截留液，除了例如第一和第二超濾造成的抗體濃度的不同和滲濾緩 沖液交換造成的懸浮緩沖介質(zhì)的差異以外。因此，在本發(fā)明的實施方案中，目標蛋白質(zhì)或抗 體產(chǎn)品幾乎沒有組成上的變化，例如降解。
[0097] 常規(guī)的超濾濃縮方法可能一般耗費更多的時間，通量效率更低，即過程時間顯著 更長，例如數(shù)天到數(shù)周，處理的體積顯著更小，或兩者兼有。
[0098] 在實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)濃縮方法可以經(jīng)過例如約1到10小時，優(yōu)選約2 到5小時，更優(yōu)選約3小時完成。優(yōu)選較高的流通量和較小的膜面積。
[0099] 在實施方案中，第一超濾可以用例如總過程時間的約35%完成。因此，例如，在總 過程時間為3小時的本發(fā)明的濃縮和純化方法中，第一超濾可以用約45分鐘完成。在實施 方案中，第二超濾可以用例如總過程時間的約15%完成，因此，例如，在總過程時間為3小 時的本發(fā)明的方法中，第二超濾可以用約15分鐘完成。滲濾可以用例如總過程時間的約 50%完成，因此，例如，在總過程時間為3小時的本發(fā)明的方法中，第二超濾可以用約90到 約120分鐘完成。
[0100] 在實施方案中，第一超濾和第二超濾可以用標稱孔徑，或分子量截留為約5到約 50千道爾頓的超濾膜完成。另一合適的標稱孔徑為，例如，約10到約40千道爾頓。另一合 適的標稱孔徑，或分子量截留，為約30千道爾頓。
[0101] 在實施方案中，第一抗體制品可含有，例如，表觀分子量為例如約100到約200 千道爾頓的第一抗體。在其它實施方案中，所述第一抗體制品可含有表觀分子量為例如 約150千道爾頓的抗體，例如當該抗體制品包含抗-IgE抗體或IgE時，參見例如授權(quán)給 Genentech, Inc.的美國專利 6, 172, 213〇
[0102] 適用于本發(fā)明的其它抗體包括治療癌癥的抗體，一般可參見例如：PCT/ US02/19592 ；PCT/US01/20118 ；PCT/US01/25464 ；PCT/US01/26626 ；PCT/US02/28859 ；PCT/ US02/41798 ;PCT/US02/12206 ;PCT/US03/11148 ;PCT/US02/12619 及