物料從槽中 抽出。然后用5psig的氮氣吹干來從槽和進(jìn)料管線排出殘余的蛋白質(zhì)溶液。最后一個階段 是吹干膜單元，此時其主要含有初次產(chǎn)物排出帶來的DF緩沖液。該階段也是使用在截留液 管線最高點施加的5psig氮氣?；厥盏目偽锪舷扔肈F緩沖液稀釋到約153g E25/L。最后， 將總物料調(diào)節(jié)為20禮組氨酸/2001111精氨酸-!1(：1/0.04%聚山梨醇20/?冊.0的最終配方。 分別分析回收的總物料、稀釋的總物料和調(diào)節(jié)過的總物料（Q-總物料）的蛋白質(zhì)濃度。結(jié) 果總結(jié)于表15。過程結(jié)束后，如上所述再生膜。
[0257] 表 15
[0258]
[0259]
[0260] 實施例7
[0261] 升高的溫度對產(chǎn)品質(zhì)量的影響
[0262] 將組氨酸緩沖液和Q緩沖液中的30g/L和150g/L的E25樣品保持在不同的溫度下 24小時。取樣進(jìn)行濁度測量和SEC分析。Q緩沖液中30g/L的E25的濁度對時間的結(jié)果如 圖18所示。圖19顯示23°C、40°C、50°C、60°C和70°C的溫度條件下經(jīng)時觀察的E25(150g/L 于50mM組氨酸緩沖液，pH6. 0中）的可溶性聚集體的量。這些溫度中的每個溫度處的四個 時段（〇小時，4小時，7. 5小時，24小時）從左至由表示為一組四個豎條，如1810和1910。 在60°C，24小時后溶液濁度基本不變。在70°C以下沒有發(fā)現(xiàn)顯著的E25可溶性聚集體，說 明這些產(chǎn)物樣品在高達(dá)至少60°C時，經(jīng)過至少24小時仍基本穩(wěn)定。
[0263] 實施例8
[0264] 升高的溫度對生物負(fù)荷的影響
[0265] 用兩種測試生物：一種革蘭氏陽性菌株（金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus))和一種革蘭氏陰性菌株（綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis))在精氨酸 和組氨酸緩沖液中30g/L的E25樣品。在1. 5小時后和6小時后取樣。圖20和21所示的 條形圖表明兩種測試生物均隨溫度增加而減少。每個觀察的時間段的3個溫度間隔（25°C， 40°C，50°C小時的溫度）表示為從左至右的一組3個豎條，如圖20和21中的2010, 2110。 所示的接種在蛋白濃度為30g/L的精氨酸緩沖液中進(jìn)行。
[0266] 實施例9
[0267] 升高的溫度對過程通量的影響
[0268] 評價0. 2M精氨酸，25mM組氨酸，pH6. 0的緩沖液10g/L的E25樣品對于作為跨膜壓 力（TMP)函數(shù)的通量的影響。圖22顯示，在UF/DF操作中升高系統(tǒng)溫度同樣增加了過程通 量。在不同的總體濃度和三種不同的溫度條件下：23°C (2210)、40°C (2220)和46°C (2230) 進(jìn)行了通量變化（flux excursions)。傳質(zhì)系數(shù)和濾液通量增加到約2到約3倍，顯著地縮 短了過程時間。
[0269] 實施例10
[0270] 高濃度配制 rhuMAB 抗-CD2〇 ( " 2H7 "）
[0271] 使用預(yù)試級UF系統(tǒng)濃縮和配制rhuMAb抗-⑶20 (2H7 ;-種重組人單克隆抗體）。 重復(fù)實施例1并作如下改變。組裝帶有17. 5平方英尺、30, 000道爾頓孔徑的再生纖維 素復(fù)合材料膜的Millipore Pelicon超濾/滲濾系統(tǒng)。該系統(tǒng)由膜固定器、Viking SlL 旋轉(zhuǎn)葉片進(jìn)料泵，1/2〃316L不銹鋼回流管道，以及40-L回流容器組成。反壓調(diào)節(jié)閥為 H. D. Baumann, Inc。利用電熱交換器、冷乙二醇補(bǔ)給或兼用二者，根據(jù)需要來上調(diào)或下調(diào)槽 夾套中充入的乙二醇的溫度。
[0272] 本次運行中，進(jìn)料流速設(shè)定為8. 5L/min (約0. 5L/min/ft2)的恒定速率。圖23顯 示在該過程的不同階段或模式，包括耶1(10)，0?1(20)和耶2(30)中，下面各參數(shù)的值的經(jīng) 時變化趨勢：進(jìn)料流速（210)，標(biāo)度為0到20 ;pH (212)，標(biāo)度為2到12 ;濾液流速（250)，標(biāo) 度為〇到5 ;循環(huán)槽液高（2320)，標(biāo)度為0到45 ;以及截留液壓差（2350)，標(biāo)度為0到100。
[0273] 在超濾和滲濾操作中，系統(tǒng)先使用恒定截留液壓力，然后用恒定進(jìn)料/截留液 Δ壓力的控制模式來控制通過膜的通量。在另外的槽中制備滲濾緩沖液（30mM乙酸鈉/ PH4. 9)。為了在整個過程中精確地控制溫度，在過程之前將該緩沖液的溫度置于45°C。該 過程之前，以單通一排出模式?jīng)_洗掉系統(tǒng)儲存溶液（0.1 N NaOH)，首先用lL/ft2的注射用水 (WFI)，然后用lL/ft2的滲濾溶液來沖洗。沖洗后，使0. 5L/ft2的滲濾緩沖液回流IOmin來 平衡系統(tǒng)。檢查回流的溶液的pH來確認(rèn)平衡。
[0274] 從在先進(jìn)行的Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質(zhì)總物料經(jīng)測定為2. 31g 2H7/ L，體積為356L。蛋白質(zhì)溶于6mM HEPES不含酸/19mM HEPES鈉鹽及25mM乙酸鈉的溶液 中，該溶液已用0.5M乙酸調(diào)節(jié)到pH 5.3。即將開始運行前，將該總物料的溫度設(shè)定點設(shè)為 45°C。將蛋白質(zhì)總物料通過0. 22微米滅菌級濾器輸送到回流容器中達(dá)到槽中約40L的水 平來開始運行。在該容器中通過頂置葉輪攪拌總物料，溫度保持于40 - 50°C。
[0275] 由于進(jìn)料的總物料大于回流容器，以進(jìn)料分批模式開始UFl過程（見圖23)。在 該模式下，以與濾液通過TFF膜排出大致相同的速率將Q-總物料加入回流容器。當(dāng)剩余的 Q-總物料被轉(zhuǎn)移到回流容器后，以分批模式繼續(xù)進(jìn)行UFl過程。在UFl中總物料被濃縮到 50g 2H7/L (約16L)。然后用10個滲濾體積的滲濾緩沖液滲濾該總物料。滲濾過程中溫度 保持在40°C -50°C。滲濾在恒定體積下進(jìn)行，這是通過使輸送到回流槽中的緩沖液的流速 與從系統(tǒng)移出的濾液的流速一致而實現(xiàn)的。滲濾結(jié)束后，進(jìn)一步在UF2模式下濃縮總物料 到最終濃度設(shè)定點>190g 2H7/L(4. 3L)。見圖23,該階段結(jié)束后引入50psig的恒定壓差控 制。還使用升高的溫度設(shè)定點45°C +/_5°C進(jìn)行該階段。然后，進(jìn)行低壓降混合，其中控制進(jìn) 料泵以維持20psig的跨進(jìn)料通道壓降。在回收之前取樣并進(jìn)行密度測量來確認(rèn)濃度。該 樣品的濃度為189g 2H7/L。表16總結(jié)了處理量和通量結(jié)果。
[0276] 表 16
[0277]
[0278] 通過一系列步驟回收蛋白質(zhì)總物料。首先利用添加到截留液管線的0. 2L DF緩沖 液以單通模式將產(chǎn)物從膜排出。使產(chǎn)物濾過0.22微米滅菌級終濾器進(jìn)入回收槽。然后用 旋轉(zhuǎn)葉片進(jìn)料泵將回流槽中的總物料從槽中抽出。然后用5psig的氮氣吹干來從槽和進(jìn)料 管線排出殘余的蛋白質(zhì)溶液。最后一個階段是吹干膜單元，此時其主要含有初次產(chǎn)物排出 帶來的DF緩沖液。該階段也是使用在截留液管線最高點施加的5psig氮氣。
[0279] 如果需要，回收的總物料先用稀釋溶液（30mM乙酸鈉，pH5. 3)稀釋到約175g 2H7/ L。最后，將總物料稀釋到150g 2H7/L的目標(biāo)濃度并利用7X調(diào)節(jié)緩沖液（30mM乙酸鈉、49% 海藻糖、0. 21%聚山梨醇20, pH5. 3)調(diào)節(jié)為30mM乙酸鈉、7%海藻糖、0. 03%聚山梨醇20， pH 5的最終配方。
[0280] 分析回收的總物料、稀釋的總物料和調(diào)節(jié)過的總物料的蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果示于表 17。
[0281] 表 17
[0282]
[0283] 注：產(chǎn)率包括由于取樣造成的損失。回收總物料體積和濃度包括緩沖液排出帶來 的添加。
[0284] 過程結(jié)束后，用0.1 N NaOH，lL/ft2單通沖洗，然后0. 5L/ft2全回流30min來再生 膜。然后用HVft2PW沖洗。然后用0. 5L/ft2的I. 4% Minncare溶液全回流30min。最后 用0.1 N NaOH回流15min并儲存。
[0285] 實施例11
[0286] 高濃度配制rhuMAB抗-CD20
[0287] 在GMP生產(chǎn)車間中，使用預(yù)試級UF系統(tǒng)濃縮和配制rhuMAb抗-⑶20 (2H7)用于人 體I期臨床研宄。重復(fù)實施例10并作下述改變。
[0288] 從在先進(jìn)行的Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質(zhì)總物料經(jīng)測定為3. 729g 2H7/ L，體積為262L。蛋白質(zhì)溶于6mM HEPES不含酸/19mM HEPES鈉鹽及25mM乙酸鈉的溶液 中，該溶液已用0.5M乙酸調(diào)節(jié)到pH 5.3。即將開始運行前，將該總物料的溫度設(shè)定點設(shè)為 45°C。將蛋白質(zhì)總物料通過0. 22微米滅菌級濾器輸送到回流容器中達(dá)到槽中約40L的水 平來開始運行。在該容器中通過頂置葉輪攪拌總物料，溫度保持于40 - 50°C。
[0289] 在UFl中總物料被濃縮到50g 2H7/L(約20L)。圖24顯示在該過程中，下面各 參數(shù)的值的經(jīng)時變化趨勢：循環(huán)槽液高（210)，標(biāo)度為0. 713963到295. 989 ;截留液壓差 (2420)，標(biāo)度為-0. 237899 到 98. 6629 ;進(jìn)料流速（250)，標(biāo)度為-0. 356981 到 147. 994 ;及 濾液流速（2450)，標(biāo)度為-0. 118994到49. 3315。然后用10個滲濾體積的滲濾緩沖液滲濾 該總物料。滲濾過程中溫度保持在40°C-50°C。滲濾在恒定體積下進(jìn)行，這是通過使輸送 到回流槽中的緩沖液的流速與從系統(tǒng)移出的濾液的流速一致而實現(xiàn)的。滲濾結(jié)束后，進(jìn)一 步在UF2模式下濃縮總物料到最終濃度設(shè)定點190g 2H7/L(5. 25L)。注意圖23中，該階段 結(jié)束后引入40psig的恒定壓差控制。還使用升高的溫度設(shè)定點45°C +/_5°C進(jìn)行該階段。 然后，進(jìn)行低壓降混合，其中控制進(jìn)料泵以維持20psig的跨進(jìn)料通道壓降。在回收之前取 樣并進(jìn)行密度測量來確認(rèn)濃度。該樣品的濃度為194g 2H7/L。表18總結(jié)了處理量和通量 結(jié)果。
[0290] 表 18
[0291]
[0292] 即將回收產(chǎn)品之前，取30mL樣品用于檢測和滴定生物負(fù)荷。結(jié)果為陰性（即， 〈0. 13CFU/mL)。通過實施例10的一系列步驟回收蛋白質(zhì)總物料。然后分析回收的總物料、 稀釋的總物料和調(diào)節(jié)過的總物料的蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果示于表19。如實施例10所述那樣再 生膜。
[0293] 表 19
[0294]
[0295] 實施例12
[0296] GMP 高濃度配制 rhuMAb 抗-CD20
[0297] 重復(fù)實施例11并作下述改變。從在先進(jìn)行的Q-Sepharose色譜步驟得到的蛋白質(zhì) 總物料經(jīng)測定為5. 106g 2H7/L，體積為196L。蛋白質(zhì)溶于6mM HEPES不含酸/19mM HEPES 鈉鹽及25mM乙酸鈉的溶液中，該溶液已用0. 5M乙酸調(diào)節(jié)到pH 5. 3。即將開始運行前，將該 總物料的溫度設(shè)定點設(shè)為45°C。將蛋白質(zhì)總物料通過0. 22微米滅菌級濾器輸送到回流容 器中達(dá)到槽中約40L的水平來開始運行。在該容器中通過頂置葉輪攪拌總物料，溫度保持 于 40 - 50°C。
[0298] 在UFl中總物料被濃縮到50g 2H7/L (約20L)。圖25顯示在該過程中，下面各參 數(shù)的值的經(jīng)時變化趨勢：循環(huán)槽液高（210)，標(biāo)度為0到300 ;截留液壓差（2520)，標(biāo)度為0 到100 ;進(jìn)料流速（250)，標(biāo)度為0到150 ;及濾液流速（2550)，標(biāo)度為0到50。然后用10 個滲濾體積的滲濾緩沖液滲濾該總物料。滲濾過程中溫度保持在40°C-50°C。滲濾在恒 定體積下進(jìn)行，這是通過使輸送到回流槽中的緩沖液的流速與從系統(tǒng)移出的濾液的流速一 致而實現(xiàn)的。滲濾結(jié)束后，進(jìn)一步在UF2模式下濃縮總物料到最終濃度設(shè)定點190g 2H7/ L(5. 26L)，且仍在該階段正好結(jié)束時使用恒定壓差控制（見圖25)。還使用升高的溫度設(shè)定 點45°C +/_5°C進(jìn)行該階段。然后，進(jìn)行低壓降混合，其中控制進(jìn)料泵以維持20psig的跨進(jìn) 料通道壓降。在回收之前取樣并進(jìn)行密度測量來確認(rèn)濃度。該樣品的濃度為191g 2H7/L。 表20總結(jié)了處理量和通量結(jié)果。
[0299] 表 20
[0300]
[0301] 即將回收產(chǎn)品之前，取30mL樣品用于檢測和滴定生物負(fù)荷。結(jié)果為陰性（即， 〈0. 13CFU/mL)。通過實施例10的一系列步驟回收蛋白質(zhì)總物料。然后分析回收的總物料、 稀釋的總物料和調(diào)節(jié)過的總物料的蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果示于表21。如實施例11所述那樣再 生膜。
[0302] 表 21
[0303]
[0304] 將所有出版物、專利和專利文件的全文通過引用并入本文，如同其分別通過引用 并入本文那樣。援引多種具體和優(yōu)選的實施方案和技術(shù)對本發(fā)明進(jìn)行了描述。但是應(yīng)當(dāng)理 解，在不超出本發(fā)明的精神和范圍的同時，可以作出很多的變化和修改。
【主權(quán)項】
1. 制備高度濃縮的抗體組合物的方法，包括： 對第一抗體制品進(jìn)行第一超濾，以提供第二抗體制品； 對第二抗體制品進(jìn)行滲濾，以提供經(jīng)滲濾的中間抗體制品；及 對經(jīng)滲濾的中間抗體制品進(jìn)行第二滲濾，以提供第三抗體制品； 其中所述第一超濾，第二超濾和滲濾中的一項或多項在約30°C到約50°C條件下完成。2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第一抗體制品的抗體濃度為約0. 1到約10克每升。3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第二抗體制品的抗體濃度為約10到約50克每升。4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第三抗體制品的抗體濃度為約50到約250克每升。5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體制品包含抗-IgE抗體。6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述方法經(jīng)過約1到10小時完成。7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二超濾使用標(biāo)稱孔徑為約5到約50千道爾頓 的超濾I旲完成。8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述滲濾在恒定體積，恒定濃度，或恒定體積且恒定濃度條 件下實現(xiàn)緩沖液交換。9. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第三抗體制品的產(chǎn)率高于約70重量％，是基于第一抗 體制品中抗體的重量。10. 濃縮蛋白質(zhì)的方法，包括： 對第一蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行第一超濾，以提供第二蛋白質(zhì)混合物； 對第二蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行滲濾，以提供經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)混合物；及 對經(jīng)滲濾的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行第二滲濾，以提供第三蛋白質(zhì)混合物；其中所述第一超 濾，第二超濾和滲濾中的一項或多項在約30°C到約50°C條件下完成。
【專利摘要】本發(fā)明涉及濃縮抗體的方法及其治療性產(chǎn)品。本發(fā)明提供了一種濃縮蛋白質(zhì)的方法，包括在高溫，例如約30℃以上依次進(jìn)行超濾、滲濾及第二次超濾的工序。本發(fā)明還包括制備高度濃縮的抗體組合物和高度濃縮的抗體產(chǎn)品的方法。
【IPC分類】C07K1/34
【公開號】CN104961797
【申請?zhí)枴緾N201510468312
【發(fā)明人】查爾斯·M·溫特
【申請人】健泰科生物技術(shù)公司, 諾瓦蒂斯公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2005年9月8日
【公告號】CA2577317A1, CN102911268A, EP1786830A2, EP1786830B1, EP2292636A2, EP2292636A3, US20060051347, US20070237762, US20090214522, US20140370003, WO2006031560A2, WO2006031560A3